发育生物学——发育生物学研究技术.ppt

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1、显微镜技术显微镜技术目的：观察胚胎个体目的：观察胚胎个体分类：分类： 光学光学(optical)显微镜显微镜: : 体视显微镜体视显微镜: : 组织分离用组织分离用 荧光显微镜荧光显微镜：显微镜技术显微镜技术激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜 (laser confocal)：荧光标记，对荧光标记，对胚胎或细胞中的特定蛋白质或胚胎或细胞中的特定蛋白质或mRNA的分布进行定性的分布进行定性或定量研究；或定量研究；图像采集的效果很好图像采集的效果很好；细胞或组织的三；细胞或组织的三维重塑维重塑 (reconstructing)组织切片技术组织切片技术目的：观察胚胎的内部组织学结构目的：观察胚胎的内部

2、组织学结构分类：分类： 石蜡组织切片：石蜡组织切片：石蜡包埋，切片机切片石蜡包埋，切片机切片 冷冻切片：冷冻切片：低温包埋剂包埋，低温切片机切片，对样低温包埋剂包埋，低温切片机切片，对样品中品中核酸的保存较好，但切片的质量差。核酸的保存较好，但切片的质量差。分子生物学技术分子生物学技术目的：检测目的基因或蛋白质在某一发育目的：检测目的基因或蛋白质在某一发育时期或特定组织中的表达时期或特定组织中的表达分类：分类： Polymerase chain reaction (PCR): DNA amplification Real-time quantitative PCR: RNA 定量定量 RT-P

3、CR/Northern blotting: mRNA expression Western blotting: protein expression 免疫共沉淀免疫共沉淀 (Co-IP): protein-protein interactionNorthern Blotting AnalysisSouthern Blotting AnalysisReal-time PCR 仪仪原位杂交技术原位杂交技术目的：检测某一特定基因目的：检测某一特定基因mRNA在某胚胎在某胚胎和组织中的分布情况和组织中的分布情况分类：分类： 放射性标记探针：放射自显影放射性标记探针：放射自显影 非放射性标记探针：非放射

4、性标记探针： 地高辛地高辛(DIG)-免疫组化免疫组化 荧光素荧光素-荧光免疫组化荧光免疫组化 (FISH)原位探测基因表达原位探测基因表达l Gene expressing guiding developmentl When and where particular genes are activel Intact embryos or sections of embryosIn situ hybrid: probes-radioactive isotope, fluorescence tag or an enzymeDectection: autoradiography, fluoresc

5、ence microscope, enzyme-substrate reaction原位探测基因表达原位探测基因表达原位探测基因表达原位探测基因表达Distribution of mRNA for the growth factor Vg-1 in the amphibian egg. In situ hybridization with a radioactive probe. (yellow signals)原位探测基因表达原位探测基因表达利用原位杂交技术研究基因表达的时空谱利用原位杂交技术研究基因表达的时空谱mRNA的检测FISH 探测基因表达探测基因表达报道基因报道基因 (report

6、er gene) 技术技术目的：目的：用于启动子用于启动子/增强子的分析研究。采用一些产增强子的分析研究。采用一些产物易于检测的基因物易于检测的基因(报道基因报道基因)与待研究的表达调控序列与待研究的表达调控序列串联，通过转基因技术导入胚胎体内，分析报道基因产串联，通过转基因技术导入胚胎体内，分析报道基因产物的表达来研究目的片断的转录调节活性。物的表达来研究目的片断的转录调节活性。常用报道基因分类：常用报道基因分类： 绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白 (GFP): 分布用荧光显微镜观察分布用荧光显微镜观察 lacZ基因基因: 编码编码 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶, 用特异底物显色研究其产物分布用特异底物显

7、色研究其产物分布 荧光素酶荧光素酶 (luciferase): 常用体外基因表达活性分析，近年开始常用体外基因表达活性分析，近年开始体内研究体内研究启动子活性检测法 P rom oter/enhancers G FP pA表达载体的构建：利用大分子间的相互作用克隆新的基因鉴定可与蛋白质结合的鉴定可与蛋白质结合的DNA序列序列分离靶蛋白质，（可采用分离靶蛋白质，（可采用gel-shift assay)克隆靶蛋白的表达基因。克隆靶蛋白的表达基因。利用利用DNA与蛋白质间的相互作用与蛋白质间的相互作用分离时空特异性表达基因的方法利用蛋白质之间的相互作用利用蛋白质之间的相互作用酵母双杂交法酵母双杂交法

8、显微注射及细胞标记技术显微注射及细胞标记技术目的：目的：将外源将外源DNA、RNA或标记物等导入早期或标记物等导入早期胚胎细胞中，如运用细胞标记技术对胚胎早期卵胚胎细胞中，如运用细胞标记技术对胚胎早期卵裂球分化命运图谱的研究。在小鼠和果蝇中常用裂球分化命运图谱的研究。在小鼠和果蝇中常用于转基因分析。于转基因分析。细胞标记物分类：细胞标记物分类： 早期：早期：活体染料如尼罗蓝或中性红，不能标记胚胎内部组织活体染料如尼罗蓝或中性红，不能标记胚胎内部组织 现在：细胞外现在：细胞外-亲脂性荧光染料如亲脂性荧光染料如DiI/Dio，不适于组织切片，不适于组织切片 细胞内细胞内-荧光标记葡聚糖和荧光标记葡

9、聚糖和HRP，需显微注射，通过荧光，需显微注射，通过荧光显微镜或组织化学方法进行定位。显微镜或组织化学方法进行定位。 示踪基因：示踪基因：GFP和和LacZ基因基因染料细胞标记染料细胞标记荧光细胞标记荧光细胞标记细胞移植细胞移植DNA/蛋白芯片蛋白芯片目的：目的：高通量筛选不同胚胎细胞或组织中基因高通量筛选不同胚胎细胞或组织中基因/蛋白表达图谱，获得不同时期或组织差异表达的蛋白表达图谱，获得不同时期或组织差异表达的基因或蛋白。基因或蛋白。 DNA chip Protein chip microRNA chip分类：分类：应用应用DNA microarrays 研究基因表达研究基因表达l Hig

10、h output screening genes expressed differently in different tissues or at different stages in development基因组时代：人类基因组计划控制发育的基因的鉴定及其表达和功能检测方法控制发育的基因的鉴定及其表达和功能检测方法后基因组时代功能基因组时代后基因组时代功能基因组时代空间结构？空间结构？胞内分布及靶位？胞内分布及靶位？影响器官？影响器官？基因类型？基因类型？底物？底物？影响途径？影响途径？从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因 自然群体中的突变体

11、；自然群体中的突变体； 化学诱变剂处理，如亚硝基乙脲乙亚硝基脲化学诱变剂处理，如亚硝基乙脲乙亚硝基脲 (N-nitroso-N-ethylurea ethylnitrosourea, ENU)； 外源外源DNA插入法，如插入法，如DNA注射、病毒感染、转座注射、病毒感染、转座子利用等；子利用等； X射线或射线或 r射线照射射线照射获得突变体的方法获得突变体的方法自发突变自发突变 (spontaneous mutation)Recessive mutation (纯合体状态纯合体状态) /Dominant (杂合体状态杂合体状态) /semi-dominant自发突变自发突变 (spontane

12、ouse mutation)semi-dominant mutation (半显性突变半显性突变)斑马鱼上斑马鱼上ENUENU化学突变研究的成就化学突变研究的成就(1996)(1996)德德国国 Tubingen 美美国国 Harvard初初选选突突变变体体总总数数42642383保保存存的的突突变变体体总总数数1163695已已确确认认的的不不同同基基因因数数372220从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因从自然或人工突变体中分离鉴定控制发育的基因化学诱变法化学诱变法通过射线或化学通过射线或化学诱变剂处理父本诱变剂处理父本个体，在其生殖个体，在其生殖系细胞中产生随系细胞中产生随机突变，

13、然后与机突变，然后与wild-type母本个母本个体杂交，体杂交，F1个体个体中可能携带有基中可能携带有基因突变。因突变。F1与野与野生型，生型，F2 (50% 杂合突变体杂合突变体)群体群体内杂交，内杂交，F3 (25%)可出现可出现纯纯合突变合突变个体，发个体，发育异常育异常 由含 GFP 基因的反转录病毒插入引起突变 正常胚胎 突变胚胎 X 基因GFP 基因 完整的 X 基因使胚胎正常发育 X 基因被 GFP 基因破坏后胚胎异常发育DNA插入诱变法插入诱变法反转录病毒插入引起的突变的鉴定反转录病毒插入引起的突变的鉴定 病病 毒毒 注注 射射 F0 WT F1 F2DNA插入诱变法插入诱变

14、法突变后的突变后的表型表型改变：改变： 致死性致死性 功能丧失功能丧失：最常见。突变后的蛋白质比野生：最常见。突变后的蛋白质比野生型活性差；某一蛋白质完全失活的突变为无效型活性差；某一蛋白质完全失活的突变为无效突变突变 (null mutation) 功能获得功能获得：如某些受体突变后活化：如某些受体突变后活化利用利用转座子转座子(transposon)或病或病毒载体做诱变剂。果蝇中为毒载体做诱变剂。果蝇中为P-因因子，可以随即插入基因组中，并子，可以随即插入基因组中，并可以在基因组中移动，包括特殊可以在基因组中移动，包括特殊序列和转座酶，后代生殖细胞中序列和转座酶，后代生殖细胞中，转座酶就会

15、诱导，转座酶就会诱导P-因子在基因因子在基因中随即转座造成基因突变。中随即转座造成基因突变。突变体获得后，克隆引起该突变的基因突变体获得后，克隆引起该突变的基因 插入突变：插入突变：利用利用P-因子序列作为探针，从突变体文库因子序列作为探针，从突变体文库中筛选出含中筛选出含P-因子的克隆，从而确定其插入点及被阻断因子的克隆，从而确定其插入点及被阻断的基因。的基因。 化学诱变或射线突变：定位克隆化学诱变或射线突变：定位克隆 (positional cloning)根据目的基因在染色体上的位置进行基因分根据目的基因在染色体上的位置进行基因分离的。通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来离的。通过

16、分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变基因的染色体位置。常用的分子标记包括单核确定突变基因的染色体位置。常用的分子标记包括单核苷酸多态性苷酸多态性 (SNPs)。Positional cloning: 1) 确定突变基因的确定突变基因的染色体定位染色体定位2) 获取该片断的基因获取该片断的基因组序列：数据库组序列：数据库3) 生物信息学确定该生物信息学确定该片段可能含有的基因片段可能含有的基因，结合其可能的功能，结合其可能的功能和该突变体的表型，和该突变体的表型，确定候选基因确定候选基因4) 实验验证：功能异实验验证：功能异常，野生型常，野生型rescue, RNAiConstructing knockout mice获得携带有特定基因获得携带有特定基因突变个体的技术，研突变个体的技术，研究基因在发育中功能究基因在发育中功能的重要方法。的重要方法。1) 1) 构建用于基因重构建用于基因重组的突变基因结构组的突变基因结构2) 2) 重组基因导入胚重组基因导入胚胎干细胞胎干细胞 (ES)(ES)3) 3) 注射注射ESES入胚胎中入胚胎中以获得杂合性小鼠以获得杂合性小鼠4) 4)