学术干货共聚焦显微镜中荧光团的共定位.docx

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1、学术干货：共聚焦显微镜中荧光团的共定位在多标荧光样品图像中，因两个或多个荧光团在显微结构中距高很近，常常会有放射信号叠加，这种效应就称为共定位。U前，高特异性合成荧光团和经典免疫荧光技术的应用、精密光切技术的应用、共聚焦和多光子显微镜供应的数字图像处理技术等大大提高了生物样品中共定位检测的实力。Co1.oca1.izationofActinandVincu1.ininNorma1.TahrOvaryCe1.1.s图1共定位在生物表述上是这样定义的：两个或多个不同的分子位于样品上同个物理位置。对显微镜中看到的组织切片、单个细胞或亚细胞器官，共定位意味着不同的分子连接到同一个受体上：在数字图像方面

2、，这个术语指的是不同荧光分子放射的颜色共享图像中的同个像素.在共聚焦显微镜中，样品被记录成含有很多像元的多维阵列数字图像，每个像元代表一个三维像素像元的尺寸（或检测单元）由物镜的数值孔径、照明波长以及共焦检测针孔直径等确定。因此，在一个样品中两个荧光探针的共定位,比如发绿光的A1.exaF1.uor488.发橘红色光的Cy3.在图像中就是由含有红色和绿色两者贡献的像索表示（常常产生各种各样的橘色和黄色）。举个例子，图1的系列图表明门骨骼肌动蛋白和黏若斑蛋白侧向光学平面上的共定位（激光扫描共聚焦显微镜中的XY而）。这些共定位点可作为肌动蛋白丝的成核位点，也可作为外部介质、质膜和肌动蛋白骨架之间的

3、交联剂。图1（a）是A1.exaF1.uor568通道（目标对象是黏若斑蛋白），由543nm的剑灰激光器激发：而FigureKb）是A1.exaF1.uor488通道（目标对象是丝状肌动蛋白），由488nm的氮离子激光器激发：Figure1.（C）是前面两幅图的叠加，表明两种荧光信号在丝状肌动蛋白纤维末端的共定位。必需指出的是，共定位并不指的是具有相像放射光谱的荧光团出现在合成图像的同一个像素上。精确的共定位分析只有在荧光团的荧光放射光谱足够分别且港色片（或光谱狭缝宽度）正确设置的状况下才有可能。荧光团放射光谱之间的大量叠加或油色片组合的不正确运用，都可能导致光谱串色，这种状况下共定位的测量就

4、没有意义。为了避开产生共定位假象，荧光团必需与照明光源的光谱细致匹配（共聚俵中是激光线），来获得最大激发效率,，同时在放射光谱之间保持肯定的分别度。在大多数状况对共定位分析来说，荧光团的选择对获得满足结果极为重要。在图2中，对A1.exaF1.uor染料家族的光谱叠加作了比较,这在共定位试验中是很有用的。为了比较，全部的放射光谱都做了归一化，德加区域用灰色阴影显示。在图2（八）中,绿色荧光染料A1.exaF1.uor488和橙黄色荧光染料A1.eXaF1.Uor555在峰波特长显示很明显的分别，人眼也很简洁能够区分。然而,光谱叠加(灰色阴影区域)表明在A1.exaF1.uor555的放射峰上很

5、明显有A1.exaF1.uor488的放射光谱(用一条黑线标示，从放射峰到横坐标)。当A1.exaF1.uor488的荧光放射强度明显比A1.exaF1.uor555的荧光放射强时，荧光信号这么高程度的串色使得荧光探针的分别很难。很多因素都会导致这种状况发生，比如荧光团标的物浓度的巨大节异。因此，在共定位试验中，这些探针的组合就应巧避开，或只有当图像在多通道共焦模式采集卜才可以运用，这样可以降低或消退串色。图2A1.exaF1.uor探针之间的光谱强加程度会随着探针放射峰之间的距离增加而卜,降，如FigUre2(b)所示。在这种状况下,A1.exaF1.uor488和深红色染料A1.exaF1

6、.uor633与FigUre2（八）比较，重叠区域明显降低。这两种染料人眼都很简洁区分，光谱重叠程度低在共定位试验中可使用色最小化，如每个探针的浓度相像的话，应节可以产生较好的结果（留意：深红色的荧光染料A1.exaF1.uor633在低浓度时通过显微镜目镜很难视察到）A1.exaF1.uor633可被红色银灰激光器的633nm线最有效的激发，也可被黄色氨笈激光器的594nm激发。或许，在A1.eXaF1.UOr染料放射的可见光区域，最好的光谱分别是A1.exaF1.uor488A1.exaF1.uor647的结合（图中未显示）。事实上，在这些染料之间没有光谱重叠，即使样品含有过量:的A1.e

7、XaFIUOr488,应当也没有串色。具有这些特点的荧光探针是共聚焦显微镜分析共定位的志向选择。在共聚焦显微镜中，测定共定位的实力受限于光学系统的辨别率及用于照明样品的入射光波长。宽场荧光和共聚焦显微镜理论辨别率约为200nm,但在事实上，由于各种缘由这个数降到400nm和600nm之间，缘由包括显微镜光路未完全对准、光学折射率波动、光学像差及样品制备的不合适。然而，对于个已经完全调好的共聚焦显微镜来说，两个荧光分子是否连接到同一个目标对象上，或者它们是否定位在同一个器官上受光学辨别率影响。共定位的很多试验是围绕高特异性的合成探针和抗体进行的，标记目标是简洁区分的局部的、明确的细胞结构。对于厚

8、度小于5m的样品，比如贴壁细胞或很薄的组织切片，在常规的宽场荧光显微镜卜.，定量的共定位分析般是可以的。然而，对于厚样品，图像应以具有肯定轴向尺寸的光学切片来记录，来分析看起来共定位的荧光团是否真正位于同个恻向焦平面上，或在Z轴上他们是否彼此叠加。厚样品的荧光团共定位分析应通过获得薄的光学切片来进行，可用激光扫描共聚焦显微镜、或转盘共聚焦显微镜或多光子显微镜。多光子显微镜常常用单个近红外激光，在物镜焦点处的特定区域激发双标样品的两个荧光团。这些技术将荧光放射局限在仅位于焦平面上的荧光团，这样大大降低了光漂白和背毋噪音。共定位的软件分析样品中荧光团共定位的程度是通过比较一幅图上每个像素位置的颜色

9、值测定的“分析的第步就是要显示进行共定位测量的图，般以两个独立通道的合成图显示。当分析多标样品时，在一次计算中，只能处理两种伪彩，但全部伪彩排列之后都可以配对用于共定位分析。由于传统上运用悬离子激光器、氧-氮离子激光器及氮至激光器，这些激光器能够有效地激发在蓝色和绿色区域有剧烈汲取的荧光团，因此选择红绿颜色对作为共聚焦荧光颜色。此外，人眼对绿色和红色色调更为敏感。图像的共定位分析一般常常用散点图表示（scatterp1.ot）,这个图将两套数据关联起来。散点图以二维图的形式描述了幅图或个感爱好区域每个像素处一个通道对另一个通道的强度值（见图3和图4）o作图时其中个通道（通常是绿色）作为X轴，而

10、另个通道（通常是红色）作图时作为y轴，在横坐。标和纵坐标上强度范围是。4095.因此，合成图的每个像素点都有对强度值。分析每一对强度值产生的分布图案，能够识别荧光团的共定位、区分背景、串色、光漂白等。图3图3描述了共聚焦的三个合成图（伪彩为红色和绿色），以及对应的散点图，三个样品荧光团共定位的程度不同。每个通道中强度很低的像素位靠近散点图的（0.0）处，而越亮的像素分散得越远。在连接红色通道和绿色通道的散点图中，纯的红色和绿色的像素点往往会团聚在轴位置。而共定位的像素（假如有的话）看起来是彩色的，具有黄色和橙色的色调（取决于共定位的程度），落在y=x位宜旁边，也就是散点图的右上附。图3a显示的

11、样品为鼠脑冠状位海马切片，用A1.exaF1.uor488标记神经纤维，A1.exaF1.uor568标记神经胶质原纤维酸性蛋白，GFAP,在图3b中，印度鹿鹿皮肤成纤维细胞用A1.exaF1.uor568染色，标记对象是黏若斑蛋白，同时用A1.exaF1.uor488与鬼笔环肽作用，标记对象是纤维状的肌动蛋白。而表达荧光蛋白DSRed和EYFP的免肾上皮细胞，定位在核上，在图3c中描述。相关的散点图干腌位于样品图像的面，例如图3d是图3a的散点图,两个通道共定位的程度在每个散点图的左下角用白色字母和数字表示。图3a共定位程度相对较小（只有百分之几），在图3b和图3c中共定位程度渐渐增加，共定

12、位系数分别是30%和85%。共聚焦显微镜及配件制造商供应的软件可对荧光团共定位进行散点图分析。图4显示了系列分析图，这个图是印度鹿鹿皮肤成纤维细胞，用A1.exaF1.uor568染色（标记对象是黏着斑蛋白，红色通道），同时用A1.exaF1.UOr488染色（标记对象是纤维状肌动蛋白，绿色通道。在散点图中选择一个感受好区域进行分析，在图4a中用白颜色的长方形为这个感受好区域设定了信号的阈值，大多数共定位分析软件都可以进行这种功能分析。感爱好区域的水平边界和竖直边界应当解除背景信号，背景沿着散点图的X轴和y轴团簇。只有被包括在所选择区域边界内的像素信号才能进行共定位分析。样品上重段的像素区域很

13、简洁转变成共定位二元阈值像（图4b）,这个图还可以和共聚焦图叠加在起，做一个共定位map.图4c显示的共定位map图用白颜色显示了共定位区域，对大多数软件这个颜色很简洁变成其他颜色，相对于原来的伪彩，对比度更高些。图4正如上面所探讨的，在共聚焦图中对荧光团共定位的定量测定，可通过散点图和感爱好区域的信息获得。从整个散点图的信息，可获得很多变量值,PearsonrS系数就是用于分析整个散点图的诸多变量中的一个，为描述两场图之间垂荏程度，在以别一场图像和另一幅图像的匹配程度上，PearsonrS1R(r)系数是标准技术之一。Pearson,s相关系数依据下面方程计算：Z(SvS1.I),Jv(s,

14、*,-1,S1是第一个通道每个像素的强度值，而S2是其次个通道每个像素的强度值。S1(average)和S2(average)分别是第一个通道和其次个通道平均像素强度值。在PearsonfS系数里，原始像素强度值减去平均像素强度值。结果，系数值范围从-1到1,-1表示图像的像素之间完全没有垂在，而1表示完备的图像重叠。PearsorVs相关系数只说明白两个图像之间形态的相像性，而与图像像素强度值无关。然而，当把这个系数值应用到共定位分析时，潜在的负值难以说明，须要用另一种方法说明结果。用于计算另一相关系数的较简洁的技术，须要去掉原始像素强度值和平均像素强度值这个差减项。正式定义为OVerIaP

15、系数(R),这个值范国从。到1,在图像分析中对强度改变不敏感。Over1.ap系数定义为:S1S2,R三V(s3,*s23,ii(2)分子是两个通道强度的乘积和，只有当同一个像素的两个通道值与共定位相关时，分子才会给出,个很有意义的值(两个通道的像素强度值都大于0)。因此，方程(2)的分子与共定位的像素数成正比。同理，Over1.ap方程的分母正比于图像两个通道组分的像素数，而不考虑共定位是否存在(用意：组分定义为通道1和通道2红颜色和绿颜色的图或像素阵列兀Over1.ap系数的个主要优点就是对个图像上各种组分的信号强度差相对不敏感，信号强度差常常是由荧光团的浓度差、光漂白、量子效率改变及非等

16、效的电子通道设置等产生的。运用OVerIaP系数最重要的缺点是：通道之间组分像素数比例会剧烈影响C)Ver1.aP系数值C为了削减这种依靠性，Over1.ap系数分成两个不同的子系数，看k(1)和k(2),以两个独立的参量来表达共定位的程度。n,EviOver1.ap系数k和k(2)描述了通道之间强度的差异，k(1)对通道2(绿色信号)强度差敏感,而k(2)线性依靠于通道1像索的强度值。因此，现在描述的方程能够说明重叠度，也能说明颜色通道之间的强度差异。在图像的共定位区域，为了估计其中个颜色通道对整个共定位荧光的贡献，定义了另外,套共定位系数m和m(2)s工以一m-：mRII共定位系数m(1)用描述通道1对共定位区域的贡献，而共定位系数m