植物中程序性细胞死亡（PCD）的诱导可能是有益的或有害的.docx

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1、植物中程序性细胞死亡（PCD）的诱导可能是有益的或有害的。在动物中,编程型细胞死亡在植物中发生,作为正常生长和发育的部分,包括繁殖，种子发芽，气管形成，气管元件分化和衰老。细胞死亡途径的调节也发生在对环境非生物胁迫的反应中。此外，细胞自杀程序在病原体攻击期间被激活，在一些情况卜与抗性相关，例如通过定义为PCD形式的过敏反应（HR）新证据表明，在死体营养型的真菌-植物相互作用中，宿主细胞死亡对于病原体而言与植物相反是有益的，表明病原体主动参与影响指导细胞死亡的宿主途径。我们一直在研究在广泛宿主范围死体营养型真菌，核盘菌的致病性发展。这种子囊菌引起400多种植物疾病。这些疾病在遗传上难以控制，因为

2、育种计划的成功有限。管理策略，包括作物轮作，由于广泛的真菌宿主范闱（几乎所有双子叶植物）而受到阻碍，并11喷雾方案已经大部分无效，特别是当高温条件有利于真菌时。双曲曲核的发白也有助于核盘菌属的致病成功。菌核是高度黑化和环境耐久的结构，其可以越冬并且在士壤中保持存活多年。W核作为接种物的主要来源，能够通过直接发芽感染宿主，或者它们可以通过子囊盘发展产生子囊抱子。核盘菌属分泌多种物质以促进其死体营养型生活方式。除了细胞壁降解的之外，草酸（OA）在已知发病机理和久菌发育中起关键作用。Sc1.erotiorum的草酸盐-缺陷突变体在所测试的所有宿主植物上都是非致病性的，并且也不能发展出菌核。草酸分泌可

3、以以几种方式增强核盘菌属的毒力。首先，在植物组织（例如多聚半乳糖醛酸榆）侵入期间分泌的许多真菌能在低PH下具有城大活性（Bateman和BeerI965）。与PH的潜在盘要性一致,核盘时丝裂原活化蛋白激励（MAPK）克隆，表征和显示为在核盘菌中形成菌核所需的。这种Erk样MAPK（SMKI）的基因表达通过OA介导的酸性PH激活。如果PH不降低，则不发生病原性发展。第：，OA还可以通过细胞壁Ca2+的酸性或螯合作用来降解或削弱植物细胞壁。第三，OA晶体已经在植物中发现并且可引起血管堵塞。OA是宜接毒性的，起非特异性植物毒素的作用。我们已经表明OA还能够抑制宿主植物氧化爆发，这是植物防御反应中最早

4、和最普遍的之一。最近，OA1.I报道干扰保卫细胞的功能，导致异常的气孔开放和抑制脱落酸诱导气孔关闭期间感染.因此,显然，当与宿主植物相互作用时，该“简单”二段酸被隹菌以多种方式使用。多功能OA对于核盘菌病原性成功的重要性由以下事实突出：OA突变体是非致病性的，即使真菌仍保持其全部的细胞壁降解他的核心.以前的研究表明，注入外源草酸盐或应用含有分泌的草酸盐的真菌培养滤液模拟实际真菌感染的疾病症状，然而,尚未建立宿主细胞死亡发生的方式。我们已经表明，哺乳动物抗凋亡基因表达的转基因烟草对核盘曲属（Sc1.erotinia）攻击具有抗性，表明致病性/细胞死亡是一种有活性的基因导向过程。根据这个前提，烟草

5、中的核盘菌属诱导的疾病在动物中共享细胞凋亡样细胞的特征，例如DNA断裂和染色质浓缩.这表明真菌来源的些组分在植物中诱导或指导PCD。涉及其他宿主-死体营养型病原体系统的研究报道了类似的观察。合起来，坏死性真菌可以选择植物宿主细胞死亡途径以建立相容性。在本报告中，我们显示核盘菌属分泌的OA是植物中的PCD的激发剂，并负贡诱导疾病发展过程中植物的凋亡样特征.这种PCD时于真菌致病性是必需的，并涉及活性氧（RoS）。我们建议OA功能通过在负贵PCD的植物中触发途径。因此.经由0A.SderotiOrUm可以使宿主细胞死亡调节机制作为致病成功的手段。此外，由硬皮菌的OA分泌不是H接毒性的，而是可以作为

6、信号分子。烟草中的凋亡样细胞死亡由草酸诱导。我们以前的研究表明，用Ssc1.erOtiorUm接种烟叶导致疾病和病变形成，其在细胞水平上通过DNA断裂和切割（DNA梯度和TUNE1.正反应细胞），与凋亡样PCD相关的特征。为了确定核盘菌属细胞提取物是否含有引起植物PCD诱导的一个或多个组分，用来自野生型1980菌株或非致病OA缺陷型突变体（A-1）的提取物处理烟草叶网片和幼苗。两种菌侏在100m1.的PD,pH7.0中培养,并以相等的速率生长。注意到培养基中PH的显着但预期的变化;在培养6天后1980或A1的PH分别为3.35t.13或5.470.16对于野生型和突变体培养物，OA浓度分别为4

7、.350.12或016005mM当植物组织用培养灌液处理时，仪在野生至海液中观察到DNA梯状。当野生型滤液高压灭菌时，DNA梯状和疾病症状仍然明显（图1C;数据未显示）。这些数据反对来自滤液的蛋白质组分负责细胞死亡诱导活性。因此，我们将注意力集中在一个明显的候选人OA上。基于我们的初步数据和以前的研咒,用草酸钾（K-OX）,pH7.0处理烟草叶片。72小时后,用20mM草酸钾处理的叶秋中出现水浸泡损伤（1A）,此外，幼苗处理对于5mM草酸钾的DNA梯状和疾病症状显示类似的反应（数据未显示）使用伊文思蓝染色测Q烟叶叶片中细胞死亡的定量和时间过程分析（图IB）.在草酸钾和水的处理中观察到细胞活力的

8、显着差异，直到开始处理后48小时。然而，从48至96小时，在草药处理的叶片中观察到细胞死亡的显著增加。到96h,广泛的细胞死亡和组织崩溃发生。较低浓度的草酸盐（例如IOmM）产生.类似但延迟的结果（数据未显示）。因此，草酸盐以剂量和时间依赖性方式诱导植物细胞死亡。基于响应草酸的细胞死亡的动力学,在几个时间点分离烟草DNA.观察到导致与凋亡性细胞死亡相关的特征性DNA梯状模式的DNA切割（图1C）。在观察到肉眼可见的疝状之前，在草酸盐处理中检测到DNA梯状。DNA断裂似乎对OA是特异性的，因为其他酸如柠愫酸，琥珀酸和盐酸不产生DNA梯（图2）DNA裂解也不依赖于草酸盐制剂，因为OA,草酸钾和草酸

9、钠均引起DNA梯状（图2,因此表明PCD。导不是由于草酸林的酸性,而是由于草酸盐本身的性顺。此外,向A1.培养物滤液中加入IomM草酸钾（pH7.0）诱导DNA梯状（图IC）。当番茄叶用20mM草酸钾预处理时，A-I突变体显示疾病表型的部分恢更（数据未显示）。总之，真菌分泌的草酸盐负责烟草中的诱导踊亡样PCD，pH和光对烟草中草酸诱导的细胞死亡的影响。PH是核盘菌病发病中的田：要因子。为了进一步评价PH对草酸盐诱导的细胞死亡的影响，我们比较了各种PH相对于草酸盐介导的细胞死亡水平的影响（图3）。叶片用用HC1.调节至pH3至6的草酸钾处理.pH明显对症状有影响（图3A），因为pH3条件导致植物

10、组织的广泛黄化和水浸泡;pH5和6显示较轻的症状，但组织死亡是明显的。出要的是，仪在pH5和6而不是在pH3或4观察到DNA梯状（图3B）。柠椽酸讷，其在调节PH和鳌介的以及抑制植物氧化爆发的能力方面类似于草酸盐（CeSSna等人，2000）,也用作对照。在所使用的任何PH条件卜.没有观察到DNA梯状。这些观察结果与草酸盐对植物PCD的特异性诱导一致，其独立于其酸性PH（4.0）调节性质。据报道，PCD通常需要光.为了确定光是否是草酸诱导的细胞死亡所必需的，将草酸盐处理的叶片在室温或黑暗中在荧光灯下温自48小时（图3C），与对照相比，在光和暗条件下的细胞死亡被显者诱导。然而，较大比例的细胞在黑

11、暗条件卜.比在光照条件卜死亡。这些结果表明黑暗条件可能增加烟草植物的草酸诱导的细胞死亡或光具仃抑制作用RoS叁与草酸创导的细胞死亡ROS（例如，过氧化氮和超氧化物）的产生被充分证明为植物时生物应激的最早和最普遍的反应。这种受控反应的频繁结果是通常口植物抗性相关的PCD,通常称为HR,氧化应激也是哺乳动物PCD的触发因素。在植物中,氧化应激显示诱导凋亡的特征,包括DNA梯状，染色痂凝聚和细胞被缩ROS调节也被认为是种发育信号，并且涉及调节几种真菌的致病性.因此，我们有兴趣确定Rc）S是否参与核盘菌病发展，更具体地说，它涉及PCD。叶片用KQX处理24小时,然后用33;氨基联苯胺（DAB）染色，其

12、通常用于检测H2。2。所有叶盘在周边具有轻微染色材料的环，可能是由于伤口的结果（图4A）。然而,经KgX处理的叶盘全部严重染色,并且与对照盘明显不同.染色强度也是剂证和PH依赖性（图4A和B）。用调节至PH3至6的K-OX处理烟草：叶圆片24小时。在pH5和6处理的叶世用DAB阳性染色;在pH3和4F的盘不是（图4B）。如我们所示，草酸盐诱导的PCD在相对较高的PH（5至6）F发生，并且在酸性PH（3至4）下没有观察到.因此,在酸性PH下没有检测到ROS的观察与PCD的映乏一致。在发生DNA梯级的较高PHF,ROS增加相应明显。因此,在ROS水平和草酸盐诱导PCD的能力之间存在非常好的关系。我

13、们研究了ROS解毒随超氧化物歧化酹（SOD）,它将超氧化物转化为H2O2,过氧化氮院将H2O2转化为水，对OA诱导的PCD产生影响。叶片用过氧化氮酊或SOD用K-OX.pH5.5同时处理，并且在处理后24小时用DAB染色，在出现水渍损伤之前。HaOz产生被过氧化氢的抑制（对于IOmM为40雎位，对于20mM的K-OX为200堆位）（图40,然而，SOD不减少与K-OX共处理中的HXh产生，并且实际上在更高的SOD处理中增强了H2O2水平（图4D）。因为SOD增加了HzOa水平，所以这个结果并不完全出乎意料。与这些观察致，在这些处理中的DNA梯度的诱导显示过氧化氢酶抑制DNA梯状，SOD没仃（图

14、4C和D）.因此，K-OX产生作为过氧化氢的但不抑制SoD的H202。H2O2代也是指示PCD的DNA梯状形成所需的。抗氧化剂的应用或CED-9的表达防止烟草中OA诱导的PCD.我们的数据表明S.sc1.crotio11m诱导植物病害涉及激活的通路终点PCD,为了深入了解介导S.sde2tiorum（A）诱导的植物PCD的途径或途径组分，各种忒剂，包括蛋白酹抑制剂E-64,抗轴化剂N乙酰半胱氨酸（NAC）和二亚茉基碘（DPI），钙流入阻断剂氯化铜1.aQ3）和维拉帕米，过氧化氢税抑制剂3-殃基三哩（3-AT）,从头蛋白合成抑制剂环己酰亚胺和丝氨酸/苏氨酸蛋白激的抑制剂K-252a用于处理具有或

15、不具有K-草酸盐以评估对草酸盐诱导的PCD的影响。DNA梯形成用作读出，因为与DNA梯状，细胞死亡和病变形成具有一致的相关性。在使用的浓度卜.，没有化学品雌独诱导细胞死亡。DP1.是NADPH氧化陶（其产生.超氧化物）的抑制机其防止由10和2（）nMK-OX诱导的DNA梯状（图5ANAC的效果较差，E-64是一种半胱双酸蛋白酸抑制剂。3-AT对草酸盐诱导的DNA梯级的抑制没有影响，如预期的，（在图IC和图5A之间的IOmMK-OX处理中观察到的梯状差异归因于图5A中增加的DN浓度）。使用伊文思蓝染色测量草酸诱导的细胞死亡与DP1.结果一致；DP1.显若阻止植物细胞死亡（图5B）,表明NADPH

16、氧化酸参与PCD的诱导。与维拉帕米，放线菌酮或K-252a以及较小程度的1.aC1.3的共同治疗对草酸盐诱导的细胞死亡几乎没仃影响，表明草酸盐诱导的细胞死亡可能不需要钙尚子通道活性，从头蛋白质合成，或一般丝纸酸/苏妖酸蛋白激醉活性。以前的研究描述了表达哺乳动物凋亡和对核盘菌属的抗性的负谢节子的转基因烟草植物的生成.挑故（DiCkman等人2001）。因为草酸盐是烟草植物中细胞死亡的激发剂，我们测试了表达CED-9的转基因烟草对草酸盐的反应。CED-9是来自线虫Cacnorhabditisc1.egans的Bc1.-2家族成员，并且是嫡虫中发育性PCD的良好抑制剂（Hengartner和Horvitz1994）在表达CED-9的转基因烟草中，细胞死亡显岩降低（图5B）,与我们以前的显示增加的抗病性的数据一致。时论PCD是真核生物调节正常生长和发育以及应激反应的主要过程（VaUX和Strasscr1996）.越来越多的证据表明，PCD的不当调节可能对生物体产生可