花生疮痂病菌毒素对寄主细胞毒性及其机制研项目可行性研究报告.docx

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1、花生疮痂病菌毒素对寄主细胞毒性及其机制研究项目可行性研究报告一、项目提出的目的和意义(1)花生疮病病国内外研究花生(Arachishypoffaea)是我国主要的经济作物和油料作物，种植面积位列世界第二位，总产量居世界第一。我国花生种植面积较广，主要分布在山东、河南、河北、安微、广东、江苏和辽宁等省区，据国家粮油信息中心提供的数据显示，2013年我国花生种植面积已达471万公顷.花生.疮痂病(SPhaCdOmaarachidisBitaucourtCtJCnkinS)主要危害叶片和茎秆，形成大量疮痂状病斑(图1)。自1940年BitaUCOUrt首次在南美的巴西发现之后，日本(根岸宽山等,19

2、79)和阿根廷(GiOrdae/R,1985)等国家也相继报道，并在各花生产区Sft行成灾。近年来，我国广东、广西、福建、山东和辽宁等主要花生产区相维发生危害，分布广，危宙重，属典型的流行性病害。一般病田减产10%-30%,严重田块损失可达50%以上.辽宁省2009年仅在葫芦岛花生产区零星发生，2011年葫芦岛、阜新和锦州多个花生产区爆发式流行成灾，病田率75%700%,病株率82.6%100%,病叶率42.5%-95.3%,病情指数I8.1.535,发生面枳超过12万hm?(周如军等,2013),截止到2015年奥季已经传播到辽宁北部产区，且有维续苣延的趋势，已成为我国花生产业持续发展中亟待

3、解决的植保问题。图I花生疮痂病典型症状特征(左：叶片症状：右，茎杆症状)花生.疮痂病(SPhaCdoiaarachidisBitaucourtetJcnkins)属近年来新流行病害，国内外研窕报道较少日本学者根岸宽山在上世纪7(1.8O年代时日本该病病原学进行了研窕，明确了病原菌为Sp/wcM。，”rac加(加(根岸宽山等，1979)。巴西学者KCamCy对病残体和种子在花去疮摭病传播过程中的作用进行了研究，明确了田间病残体是该病初侵染源之一(KCamCyerR,2002),以菌丝体和分生抱子盘在病残体上越冬，翌年产生分生抱子，借助风雨传播。国外尚未见其他相关研究报道。目前国内研究主要集中在病

4、原学、发生调查(方树民等.2007：李峰等，2012)侵染特性(郭陞毒等，2015)化学防治(田云云等,2014)等领域，申请人近年来在其病原学、潦行因索分析、流行动态、扰性鉴定和田间防治等方面进行了系统研究并取得了相应结果(周如军等，2012,2014)。而国内外在病害致病因子、侵染机制、寄主与病菌互作等方面尚未见研究报道，研究基珈较为薄弱，极大限制f该病害的深入研窕，无法为后期抗病育种和新型防控技术研究提供理论基础。(2)植物病原真菌毒素在致病过程中的作用机制植物病原页菌与植物在长期协同进化和更杂的互作过程中，逐渐形成有利于致病性的进化，产生多种对寄主植物有击的物质统称为致病因子，致病因子

5、的种类、含量及其活力决定其致病力强弱，进而影响病害的发生和严重程度。近年来,病原真菌致病因子及其机理研究已成为植物病理学的研究热点。研究表明，病原真菌致病因子主耍包括旃类、毒素、激素和蛋白类等多种物质4|,其中毒素是尾刑菌(Cervospora)、镰抱菌(Fus(Irium)链格胞(A1.temaria)等多种重要植物病原真菌的致病因子。研究病原真菌毒素及其作用机理对r解病菌致病机理、寄主与病原物的互作机制、抗病育种和寻找新的病害防治途径具有重要意义。病原真菌毒素种类繁多，主要包括蛋白类，如小麦褐斑病菌(PywwMomtriticirepenis)产生的PTR徐素和棉花黄萎病菌(讪涓山du/M

6、iae)产生的VD奇素，：糖甘类，如甘蔗眼斑病侏i(Hdi而sporiSaE加rf)产生的长蝇白糖：脂类，如甜菜尾胞病菌(cezwsp”儿e产生的甘油三酯类毒素：杂环类(花酿类、酚醍类、不龈类等)以及氨基酸衍生物等类群。其中非配类毒素由于其具有光敏性可引起膜蛋白交联、膜脂过氧化、膜潦动性改变、细胞竹架损伤、DNA损伤等作用而备受瞩目。花旗类诟素主要包括交链胞毒素型、弗莱菌素里以及以金丝桃素为代表的其他类毒素。其中弗莱菌素型包括的尾胞菌素和痂囊腔菌爵素是倒萄黑痘病、柑橘疮痂病、大豆收斑病、玉米灰斑病等重要作物病害的主要致病因子。前期研究衣明尾抱菌毒素痂囊腔菌毒素是病菌侵染寄主植物的重要毒力因子(

7、1.iaotz/.2(X)8)o尾胞菌素(CercosPOrin)是由尾他属真菌(CtVWS”加)产生的红色的毒素，首次在(CerVO$叩2Aikuchii)中分离得到(OkUboeR,I975)痴囊腔菌素(EISinoChmme)是由痂囊腔曲(Eg决)产生的红色或橘红色的毒素，1957年Wciss等人首次在痂囊腔菌属真菌中发现，主要包括A、B、C和D四种衍生物(Weisseta1.1964：1.oUSbergeta1.,1969).尾抱菌素与痴囊腔菌素的生物合成还受到众多生理生化、物理因子的影响，其中光和氧气是两个必不可少的关键因素。CERSPORINCercosporaipp图3足用的素结

8、构图2布囊腔苗素结构花根类植物毒素(尾弛菌素与痂囊腔菌素)具有明显的光敏作用，在Kuang-RenChUng等人对大豆灰斑病、柑橘疮揄病等病害的研究中，证明光有利于北阻类植物毒素的产生I1.与其毒力大小为定的相关作用，光存在时会与氧反应产生对细胞有毒宙作用的活性氧,光敏作用一般分为类型【和类型H两种机制，光敏剂吸收光后，首先激发到寿命很短的单或态，然后系间穿越到三重态，后者相时单选态来说更稳定，寿命更长，因而光做作用通常通过三重态来进行。光敏剂的三重激发态可进行两种类盘的反应：机制I通过电子转移或抽药反应与底物相作用，产生底物和光敏剂的自由基，这些自由基与周阳的氧反应产生氧化物，如超氧阴离子自

9、由基(02)及羟基自由战(OH)等；机制H光破剂的三重态与基态氧发生.电子转移或能量转移产生超氧阴离子自由基(02)和雌重态氧CO。，后者是一种高亲电反应活性的物种,能行效地氧化生物分子(Guedesera/,2007)。在光敏作用中I型机制和H型机制同时出现，它们的相对强弱取决于溶剂极性、底物和光敏剂的特性和浓度、氧的浓度以及光敏剂与底物间的键合作用。由此可知氧与光敏作用密切相关，I1.在大多数光敏反应中O2是主要活性物种,但0?和QH的作用也不可忽视。活性氧(ROS)在寄主植物和微生物相互过程中起到重要作用。如在细胞发病机理过程中,NADPH氧化旃(NOX)信号诱导氧爆发以及程序性细胞死亡

10、的反应是寄生对入侵病原体的防御反应.与病原真菌后接触后，植物质膜结合的NOX活性提育,导致包括过氧化级(HQC在内的活性氧的快速枳累，其扩散进入细胞并激活植物防御(APdeta1.,2004)。最有代表性的植物防御反应是由ROS的积累和ROS清除旃的抑制产生的程序性细胞死亡响应，即过敏性坏死反应。ROS也参与防御的其他模式，如形成细胞壁的氧化交联的障碍以及抑制病原体侵入(Shct1.yefH,2008)。花胆类植物毒素产生的活性氧(ROS)对寄主植物细胞具仃极强的毒害作用。产毒病原真菌的致病机理包括三个可能过程：1)病原菌在侵染前释放毒素作为信号分子：2)择放的港索选择性地和寄主细胞上的受体位

11、点结合：3)解放的毒素抑制植物对真菌的侵染和定植的防御反应。因此，毒素对寄主产生的生理生化影响往往是通过与寄主体内的一种或几种生物大分子(靶分子)相互作用产生的.毒素进入寄主体内，通过与寄主体内特定靴分子相互作用，改变寄主原来正常的生理过程，引发一系列细胞学和生理生化反应，并最终使寄主产生一定的症状，如镰刀菌产生的毒素致使植物萎蕉，链格把毒素使寄主坏死，长蠕泡毒素使植物产生褪绿现象；尾抱属及痂囊腔菌属产生的毒素可使植物细胞膜过氧化，导致病害扩大危害，病情加重。尾胞菌素与痂囊腔菌素等花瓶类毒素均为脂溶性，在渗入细胞后可以作用于多种细胞器，包括溶的体、内质网、高尔基体、甚至破坏含有核酸的叶绿体和线

12、粒体以及细胞核等。尾胞菌素与痂囊腔菌素主要作用位点在细胞膜上,如在烟草悬浮细胞及柑橘原生质体中，添加尾泡菌素与痴囊腔菌素均能使细胞死亡。尾抱曲素与痂囊腔曲素在细胞间通过光敏作用产生的Q?以及其他活性氧种类，使细胞膜过氧化，电解质泄露到细胞间,为病原菌正常生长和产泡提供营养条件.接种叶片及培养液的初始电导率及总电导率的测定显示叶片中以及细胞中的电解质泄露到溶剂中，证明细胞膜的流动性降低，细胞内电解质泄露，细胞膜破裂，导致细胞死亡花生疮痂病为辽宁省花生产区新爆发式流行性病需，发生.区域广，危杏极为严重，殷病田减产10%30%,严重田块损失可达50%以上。仅辽宁2011年发生面积超过12JjhnR形

13、成爆发式流行，危击极为严亚，且有向北继续鹿延的趋势，已花生产业持续发展中酮待解决的植保问题。而国内外对于花生疮痂病的研究基础较为薄弱，缺乏病菌侵染过程、致病因子筛选、致病机制及寄主损伤机理等基础研究工作，无法诠释病菌与寄主之间的互作关系和互作机制，对F该病害的深入研窕及后期的抗病育种、新型安全防控技术的开发带来了巨大的理论屏障。本项目以花生疮加病菌为研究对象，深入开展花生疮痂病菌毒力因子筛选、毒素在致病中对寄主植物损伤和细胞凋亡作用及其作用机制等研究工作，探索花生疮痂病菌与寄主的互作模式和机制，研究结果该病害的深入研究和后期花生的抗病育种具有全要意义。结合申请人前期对辽宁花生疮痴病侵染过程和流

14、行因素的研究基础，本项目的研究结果可以很好地解释近年来辽宁花生产区花生疥痂病爆发式流行因素和流行机制。项F1.研究过程中会建立花生细胞悬浮体系，并对各种因素进行优化，该技术对于花生的遗传转化和功能基因的转化提供材料和技术支持。另外，本研究中将会探讨淬灭剂和金属离子对花生疮痂病菌毒素的缓解和抑制作用，进而减轻病害的发生和流行程度，该部分研究结果对于寻找新型、安全的病害防治方法提供了理论支持，对于花生减量使用农药具有重要意义。花生已成为辽宁省第三大作物，种植面积早已突破600万亩，且随着农业产业结构调整，玉米栽培面积减少，花生产业的发展势头持续见好。而花生疮痂病为辽宁省花生产区新爆发式流行性病害，

15、发牛.区域广，危需极为严重。结合前期研尢，该项目的顺利实施，不仅能够完善花生疮痛病的致病机制的理论探讨，同时对于我省花生产业的健康发展和农民增收具有重要意义.二、项目研究内容和研究方案1 .研究内容(1)花生疮痴病菌毒素对寄主细胞的毒性利用花生细胞悬浮培养体系和致病性测定，明确花生疮痂病菌毒素含量与细胞死亡率和病斑扩展动态之间的关系，确定花生疮痂病曲毒素在致病过程中的歪要作用。(2)花生疮病病菌毒素在寄主-病菌互作过程中的作用机制花生疮痴病三毒索对寄主防御的影响动态测定花生疮痂病菌毒素对寄主防御海的响应动态，确定毒素对寄主生理生化的的影响，进一步证明花生疮痂病的毒索是否为花生疮掘病菌的毒力因子

16、。O花生疮痂病菌毒素对寄主细胞质膜过氧化的影响利用细胞悬浮体系通过测定寄主细胞膜的选择透过性、流动性、细胞膜施活性和质膜过氧化程度，探索毒素对寄主植物细胞膜水平的毒害作用“。花生疮疝病菌毒素对活性氧产生动态及细胞需亡的作用机制利用细胞悬浮体系测定花生细胞程序性死亡过程中的1。2、Of以及H?O?三种不同活性氧种类及其含量.分析与细胞凋亡的关系，明确毒素对花生细胞凋亡的作用机制。(3)淬灭剂对花生细胞毒性和膜损伤的抑制作用明确淬灭剂种类和浓度对寄主细胞凋亡的缓解或抑制作用,通过添加不同类型的活性氧淬灭剂，探索不同类型活性氧作用，进一步证实毒素在花生.疮痂病菌致病中的主导作用。2 .研究目标和拟解决的关健科学问题(I)花生疮斑病毒素对寄主铀胞的毒性及其机制；从细胞程序性死亡、抗性根响应、细胞膜损伤和活性氧等方面揭示菌毒素是花生疮痂病菌的或要致病