免疫固定电泳操作规程.docx

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1、免疫固定电泳操作规程项目名称免疫固定电泳(HYDRAGE1.1.MMUNoF1.xATIe)N)二.检验方法名称琼脂糖凝胶免疫固定电泳三.方法学原理血清蛋白电泳中出现的异样条带主要存在于B-球蛋白和Y-球蛋白区域，通常疑为单克隆蛋白质并且提示丙球蛋白血症。为鉴别异样条带，可运用免疫固定技术。免疫固定电泳是一种简洁的技术，电泳后的蛋白质与相应抗体形成复合物和被固定在相应的位置上，通过下列四个步骤：1 .蛋白质在琼脂糖凝胶内进行电泳分别。2 .电泳后已分别的蛋白质被固定并产生免疫沉淀：应用固定剂和抗血清加于凝胶表面的泳道上，并让固定剂和抗血清在凝胶内渗透扩散。3 .运用吸水纸和清洗将未沉淀的蛋白质

2、去除，已被沉淀的蛋白质贮留在凝胶内。4,将蛋白质染色，并将这些免疫沉淀区带的位置与蛋白质经电泳后视察到的异样蛋白区带进行比较。为了精确识别单克隆区带，样品同时在六条泳道上进行洌J试。经电泳后，E1.P作为参考泳道以显示电泳后的蛋白质。其余五条泳道用于鉴定单克隆成分。通过它(们)与抗血清，y(1.gG)、a(1.gA)、(1.gM)重链和k、轻链(游离和非游离)反应与否进行鉴别。该技术简洁、快速、图象清楚.易于说明结果。四.方法学溯源自1930年由Tise1.ius发觉了移界电泳(movingboundaryeectrophoresis),而后，这种技术的各种局限性已渐渐被区带电泳(Zonee1

3、.ecrrophoresis)所克服.区带电泳的条件和支持介质的选择是电泳成败的关键，,通过免疫化学手段视察其电泳特性与抗原特性是鉴定某一蛋白成分最好的方法，免疫固定电泳技术是目前应用最广泛的方法之一。五.仪器(-型号：SEB1.AHydrasys(pni210)分析和计算参数：1 .处理量：约18个样本/小时2 .所需样本量：IOuI3 .检验时间：约55分钟4 .重复性：有良好的批内和批间重复性5 .电泳参数：电压0-3OOV(可选至300OV)电流0-50OmA功率。-100W六试剂与配套品试剂1.HYDRAGE1.1.1.F试剂盒HYDRAGE1.2IF试剂盒HYDRAGE1.4IF试

4、剂盒HYDRAGE1.9IF试剂盒商标：SEB1.A包装规格：10测试/20测试/40测试/90测试货号：PN4301PN4302PN4304/PN43092 .脱色液(1)商标：SEBIA(2) 包装规格：Packfor10100m1.(3) 货号：PN4540(4) 成分：柠椽酸3 .洗涤液(I)商标：SEB1.A(2) 包装规格：Packfor1080m1.(3)货号：PN4541(4)成分：叠氮钠4.稀释剂商标:SEBIA(2)包装规格：PaCkfOrIX5m1.(3) 货号:PN4587-配套品：IF试剂抗体(1)商标：SEBIA(2) 包装规格：Packfor51.m1.(3) P

5、N4315七.操作步骤开机，启动电泳仪。将1只（用于1,2IF）,2只（用于4IF）或3只（用于9IF）点样梳置于整表面，有数字的一端向上，在2分钟内完成每块加样梳的加样，每孔加IoU1.样品，然后齿梳向上把加样梳放于湿盒内5分钟“电泳/免疫固定泳道孔号E1.PGAMK1.Hydrasys1IF123456Hydrasys2/4IF1或3号样本2345672或4号样本91011121314Hydrasys9IF1.4或7号样本1234562.5或8号样本7891011123.6或9号样本131415161718选择相应的hIF电泳程序，W从包装袋内取出缓冲条.将其固定在电极支架背侧的钉上,再取

6、出凝胶，用薄滤纸快速轻轻地吸去凝胶表面多余的液体，在温控板表面下1/3处加200U1.蒸僧水或去离子水，将凝胶片底边紧靠框架底边，边缘对齐边线,略弯曲凝胶片渐渐放平,留意凝胶片下面勿出现气泡。自然放下支架，从湿盒中取出加样楂并去除齿梳下的爱护支架，1、2IF的点样梳置于支架6号位，4IF的2只点样梳则分别置于3号和9号.9IF的3只点样稿则分别置于2,6号和10号,留意点样梳上的数字必需面对操作者，关上电泳舱盖，按下键盘左侧的绿色箭头START键，电泳起先,确保仪器右侧的空气通道不被堵塞。六电泳仪自动发出蜂鸣声,提示电泳结束，进行免疫固定操作。打开电泳盖，将加样梳和缓冲条丢弃，移走两支架，用湿

7、纸巾擦拭电极丝，将抗体加样条装入抗体加样架上，按如下要求将动物血清抗体加入抗体加样条：-HydrasysIIF用6孔抗体加样条:每孔加81.抗体-Hydrasys2/4IF用15孔抗体加样条:2人份每孔加81.抗体，4人份每孔加121.抗体-Hydrasys9IF用18孔抗体加样条：每孔加81.抗体固定好抗体加样架,将抗体加到凝胶片上。然后关上电泳舱盖，按uStarf键起先免疫固定。出10分钟后，电泳仪自动发出蜂鸣声，提示PAPERB1.011NG,移走抗体加样架，弃去抗体加样条，放一厚滤纸光面对下盖于于凝胶表面，左手固定好滤纸，右手手指用力的摩擦滋纸表面，留意勿将滤纸移动，关闭电泳舱盖，按-

8、Start键起先凝胶表面多余抗体的汲取。网3分钟后，电泳仪自动发出蜂鸣声，打开电泳舱盖，移去遮纸.关闭舱盖，按uStart键起先凝胶片的干燥。6分钟后，电泳仪自动发出蜂呜声，打开电泳舱盖，取出凝胶片，用湿纸巾擦拭温控板.将胶片固定于凝胶支架上放入染色空间中，在检查洗液瓶中是否有40Om1.洗液，染色液瓶内是否有30Om1.染色液，脱色液瓶内是否有100Om1.脱色液以与是否排空了废液瓶后，菜单上选择染色指令，按Start键起先染色。阳在染色、脱色以与干燥步骤完成后，电泳仪自动发出蜂鸣声，取出凝胶支架，将铁干的胶片取下。A.临床意义对多发性骨髓瘤、WaIdenStrom巨球蛋白血症、分泌型骨髓瘤

9、、轻链病、垂链病等探讨有重大意义。1 ,正常人体内有正常的免疫球蛋白分布，故免疫固定电泳图谱可见匀称分布的IgG/A/M2 .在IgG/A/M与KaPPar、Iammda的泳道上发觉浓集的条带即为病理性的。九.标本要求取簇新血清进行分析，依据临床试验室对各种试验所运用的操作程序进行血清样本的采集.样本苣于冰箱内(2-8Co)可保存一周，若冰冻可延长保存时间至少一个月。冰冻的血清样本加入002gd1.的叠氮钠可以增加其存放稳定性。为避开抗原过剩引起的带现象，血清于加样前应先作如下稀释，并混匀。泳道血清（UI）稀稗剂（UI）蛋白电泳（E1.P）和其他免疫球蛋白固定泳道3060IgG免疫固定泳道20

10、100况 当总免疫球蛋白的水平20g1.,稀释剂量加倍（除了E1.P泳道） 当总免疫球蛋白水平5g1.,稀释剂量减半（除了E1.P泳道） 冷藏或冰冻后，某些样本（尤其是含有冷球蛋白或冷凝胶）可能变得粘稠或混浊。这种样本可能由于扩散障碍而存在点样问题。在这样状况下.加25u1.液化剂于75m1.血清中，混匀15秒。然后按规定程序接着进行。某些单克隆蛋白质可能因多聚体而导致全部的免疫固定泳道上均出现单克隆片段。在这样状况下打算1%B-筮基乙薛（这种还原剂可在室温于未封闭微管内保存1周）（ii）加25u1.还原剂于75u1.血清中（iii）混匀并令其反应至少15分钟（至多3小时）后按规定程序接着进行。避开运用血浆标本。+.操作留意事项为达到最佳检测效果，同一试剂盒内的全部组分必需一并运用。用薄滤纸吸去凝胶表面多余液体时，接触时间不能太长.应快速移去,以免凝胶脱水。留意先挂缓冲条再放凝胶片，缓冲条取出时应匀称挤捏使缓冲液能分布匀称O