免疫-PCR技术进展.docx

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1、痛要：免疫-?CR技术结合了抗原抗体反应的特彳性和PCR的高酸感性,是一种极为5或的抗原检测技术.并结合于各种徵黑抗原的检测。荧光标记、酶标记和放射性同位素标记这三大抗体标记技术是目前免疫化学、免覆学以及分子生物学中应用最广的常规抗原检测手段，具有很离的煲敏度。但在早期悠抗原及某些神及肤等根筑抗原检测上,荧光标记及解标记技术坯缺乏足够的灵敢度。放射性同位素标记技术的灵敏度虽然能达到1.ngm1.但在实际操作中由于须要特殊的设备和平安防护，因此限制了它在实际过程中的广泛应用.1992年，SanoC1.等人将免疫测定技术与？CR结合,创建了一种全新的极其敏感的抗原分子检洌技术，即免疫-PCR（Im

2、muno-PCR）它的出现解决了上述三种抗体标记技术的不足之必。众所周知，PCR技自从1985年问世以来，经过十几年的发展,已成为试验空的常规技术，也是现代分子生物学探讨中不行映少的手段.是一种极为敏感的放大系蜕。而免疫-PCR技术正是运用PCR的高度较感性来放大抗原抗体反应的特罪性，使试验中只需数百个抗原分子即可桧利,甚至在理论上可检测到一至数个抗原分子。效种灵敏度使免疫桧测技术达到了一个新的商度。1免疫-PCR的基本原理免疫-PCR主要由两个部分蛆成。第一部分是类似于一般醒联免疫吸附试验（E1.ISA）的抗原抗体反应。其次部分即第规的PCR扩增和电泳检测。免疫-PCR与E1.ISA的区分就

3、在于E1.ISA是以保性碳酸酶或辣根过新化物酶来标记抗体，用颜色反应来表明阳性或阳性培果,而免疫-FCR则是以一段特定的双钻或单伍DNA来标记抗体.用？CR步增抗体所连接的DNA,并进行电泳抽测,因此可由PCR产物的鼻来反映抗探分子的.由于FCR的高JriS实力,只要存在着被微量的抗流抗体反应，PCR部能大量扩他抗体所连接的DNA分子，再用电泳来表明试晚结果C免疫-PCR的关钳N必就在于用一个连接分子将一段特定的DNA连接到抗体上，在抗原和DNA之间建立相对应关系，从而相对蛋白质的检测转变为对核酸的怜测.堰初San。等人建立的免疫-PCR试助流程如下：（1）再包被续冲液稀释抗原BSSA,并固定

4、在微滴定板上。（2）微滴定板上加入相应的已稀释的单克隆抗体.并洗去未结合的抗体分子。（3）加入稀样的已与生物素化PUC1.9的结合的慎亲和素-蛋白A嵌合体（蛋白A能与抗体结合，而链条和素可与生物素化PUC19中的生勒紊拮合），并洗去未结合的嵌合蛋白-PUC1.9复合物。（4）PCR扩增沆体所连接的PUC1.9。5）琼跖枪凝胶电泳，EB显色检测PUC1.9.运用这种方法，San。等人可检测到600个BSA抗原分子。与用礴性微酸酶作为标记物的E1.1.SA方法相比.免疫-PCR的敏感度比E1.ISAS106在这免疫-PCR系线中，谊亲和索-蛋白A嵌合体作为一个连接分子起着桥梁作用。它的两个独立结合

5、位点蛋白A和被亲和索分别与IgG的Fc段和生物素化DNA中的生物案结合，从而在蛋白质和核酸之间建立对应关系,通过FCR扩增.将抗原抗体反应的特异性高度放大.因此，免度-PCR结合了抗原抗体反应的特纤性和PCR的高度敏或性，成为一种极为敏麻的抗体依靠的抗原检测技术。（!-empirenews.page-2免疫-PCR的改进虽然Sano等人构建的免疫-PCR具有极高的灵敏度，但Sano所用的连接分子慎亲和素一蛋白&嵌合体还没有商品化,因此限制了它在实际应用中的广泛普及。RUZiCka2；等人以生物素化的抗体取代Sano免疫-PCR嘉蜕中的抗体.用商品化的亲和索代替慎亲和索-蛋白A或合体作为连接分子

6、构建了一个新的免疫-PCR系统。Ruzicka用此免疫-PCR系统检测小鼠抗载脂蛋白E抗体。可以检测出包被浓度为10fgm1.的E抗体。此外.Sano的免疫-PCR试验流程须要众多的洗涤步骤，使试验过程相当繁琐.并须要大的携作时间。ZhoU1.31等人对此作了改进,他们用生物索化的二抗和游圈位亲和素作为连接分子进行免疫-PCR试坡.把每个步骤的洗涤次数从原先的？15次减至35次.从而削减了操作时间.但不影响试验结果的精确性。另外，用修饰过的抗原稀稀缓冲液（modifiedantigendi1.utionbuffer,MADB）代替SanO免疫-PCR中的TBS作为抗原稀释液,它主要把TBS中部

7、的浓度调到2M,由此解决了抗温的溶解问包。ZhoU检测了人僚感基因ETSI,检测浓度可达到9.6*10-15M,是常规E1.ISA的105倍。与SanO的免疫-PCR束烯相比.RUiZiCka和ZhOU所用的方法不须要特殊的试剂，生物素和亲和素（慎亲和索）郡已任商品化，因虻在实际未作中得到广泛应用4.但干脆包被待松抗原不适用于临床标本和炮以吸附固相抗原的检测。径后在一系列试购中建立了各种夹心免疫-PCR510,扩大了检测范国。然而亲和素（隹亲和素）作为一个连接分子对生物索的结合具有4价特性.亲和索与生物素化DNA结合可得到5种不同产物，即游禹亲和素、结合饱和亲和素同部分饱和亲和崇才旎在检测过程

8、中发探作用,游离亲和素与因相中生物素化抗体结合会降低方法的敏或性1.1.3多分析物免疫-PCR在以上的免疫-PCRia验中，生物素化的DNA通过不同的生物素结合试剂（链条和素、亲和素）连接到生物索化的抗体上。这样,DNR标记和抗体就被组装在同一位点上,因此可能产生可变的化学计18。另外它须要微外的步躲加入生物素滋剂和连接试剂,并须要众多的洗涤步骤去除过的试剂和非特异性连接试剂的试验组分，作为一个免旗-PCR试验扬相当困难且须要相当多的茶作时间。HendECkSOM12）等人用异双功隹化学交联剂预先连接好抗体和SSDNA标记，形成标记DNA-抗体偶联物。特殊是，他将不同的抗体标上特异的DNA序列

9、,形成一种新的、基于双抗夹心免疫模式的免疫-PCR,并可同时检测多种抗原，避开了免疫试睑敏感性的限制和在一个试验中检测抗株的种类。而且.免疫-PCR夹心模式可以用常规的免疫试验完成。这样就大大降低了原先免疫-PCR设鸵的困雉性，并削减了大显的操作时间。这种免疫-PCR系统的关键改迸就是用异双功能化学关联剂制备标记DNA-抗体偶联物。制备过程如下.（1）氨基修饰寡核甘酸与SATA反应，形成乙酷硫代乙域修饰DNA。（2）Su1.f。-SMCC与抗体反应,形成马来欧亚版修饰抗体。（3）混合马来酰亚SS修饰抗体和乙戢减代乙酰修饰DNR,并加入羟放盐酸，在黑暗条件下反应，使抗体和标记DNA偎朕。（4）反

10、应混合物用HP1.C麓胶过滋施化偶联物,收集的偶联物在4T保存。!-empirenews.page-在这偶联物中,ssDNA是连在抗体的FC段上，因此并不影响抗体的活性.Hendrickson用此方法把设计独特的三种寡核甘酸（分别为55、85、95个碱基）分别共价连接到三种分析物hTSH、hCG.B-Ga1.的特异性抗体上,每一个寡核甘酸标记物含有相同的引物序列。这样.一对引物就可以促成三种DNA的共同扩群，HendriCkSOn用预先制备好的三种抗体-RN&偶联物同时蛉测hTSH、hCG、B-GaI试验运用双抗夹心欧式。斌脸结枭表明,分析物检测的敏娥度超过般E1.ISA约三个致墨圾。由于化学

11、合成寡核甘酸标记物序列长度不能超过100个碱基,因it,在多分析物免疫-PCRia.33DNA标记物和引物的设计就受到了限制。JOerger13）等人用dsDNA作为标记物与抗体偶联。几千个bP的dsDNA可以通近生物学和生物化学方法制缶。Joerger通过PCR和单向缺失在以PUe1.8为基础的市组质粒上制备了各种长度、具有相同引物序列的的dsDNA,选择是合长度的d2DNA作为特异性抗体的标记物。另外,在免疫-PCR试版中.CiSDNR比SSDNA具有更多的优越性。DSDNA中的一条链跟抗体的FC段连接,另一条送在PCR第一步变性步骤中就释放到溶液中,使链复制没有空间位阻。而且dsDNAf

12、tSSDNA具有更高的稳定性。此外，长域DNA分子更简单用荧光标记和光汲取检测，并且可以引入更多的非同位素标记，序列长度的提高可以促进杂合检测。4免疫-PCR扩增产物的E1.1.SA检测PCRIrIS产物一般是通过凝胶电泳、EB染色来检测并定整的。也有的是在凝胶电泳后用SOUthern杂交来检测PCR产物（8,9,14）。1997年，Niemeyer15提出所弱的免疫-PCR和PCR-E1.ISA检测,即用E1.ISA方法来检测并定?CR产物。它主要是用一对分别标记了生物索和捕获抗体因定犷塔产物,用标记上退性磷酸陶的抗她高辛抗体进行双抗夹心E1.1.SAINiemeyer分别检测了鼠IgG、兔

13、IgG和王组HbSAg,证明与斑胶电泳、EB显色相比,E1.ISA方法检测定索PCR扩增产物结果目有更高的稳定性和可审复性。凝胶电泳、Em显色的变55系数CV达到38%,而E1.1.SA的变异系数只有10%而且，以荧光染料Att。PhOS作为显色底物的E1.ISR检测灵缀度比凝胶电泳、EB显色高10倍。另外，荧光强度和抗朦检测JE的相关彖数也高效99%。这种PCR-E1.1.SA更节约时间，目易于自动化操作和便于临床检测。5展猪免疫-PCR作为一种抗原检冽系统,同时具有抗原抗体反应的特异性和PCR的高敏娥性、是合于各种被基沆除的检测（16）,并且可以干脆检测细胞上抗隙14。预先将抗体和标记DNA偶联,微化了试验操作，并可以同时检测多种抗原。而标记沏和引物被设计为带有东和配体,则可以用常规E1.1.SA方法进行检测。演若免疫-PCR技术的进一步发展完善.免疫-PCR的功能将得到更充分的发展，新的标记物和引物设计将扩展可检测分析的范国.简化设验的困难性。具有恻域DNA标记物的俚联物能够担当的标记物的检测.产生更精确的结柒.信任不久就会有商品化的免疫-PCR试剂盒问世。