先天性小耳畸形全基因组甲基化谱的建立.docx

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1、先天性小耳畸形全基因组甲基化谱的建立（先天性小耳畸形全基因组甲基化谱的建立#林琳，宋宇鹏，潘博，蒋海越，韩娟*（中国医学科学院整形外科医院，北京100I44）摘要：目的筛查先天性小耳畸形患者整个基因组存在甲基化水平异样的CpG岛和CpG位点及其相关差异基因，进而探讨基因甲基化水平的异样与先天性小耳畸形发病之间的关系。方法收集我院先天性小耳畸形患者术中废弃的残耳软骨组织为探讨对象（试验组）3例，非耳畸形（耳外伤）患者的正常耳软骨组织3例（比照组）。应用Nimb1.egenCpG启动了芯片，对两组样本的基因组DNA进行全基因组28226个CpG岛扫描,筛选存在CpG岛甲基化水平差异的基因。结果试验

2、组与比照组在全基因组范围内存在36个具有甲基化水平差异的CpG岛，其中有29个与已命名的29个基因相关。结论初步建立了先天性小耳畸形甲基化谱，发觉的36个具有甲基化水平差异的CpG岛（包括其中已命名的29个基因）可能与先天性小耳畸形发病相关，有待进一步试验验证。关键词：小耳畸形：DNA甲基化：CpG岛510ISEstab1.ishmentofDNAMethy1.ationProfi1.einCongenita1.Microtia1.in1.in,SONGYupeng,PANbo,JIANGI1.aiyue,IIANJuan（P1.asticSurgeryHospita1.,PUMC1Bciji

3、ng100144)Abstract:ObjectiveScreeningforabnorma1.methy1.ationinCpGis1.andsandCpGsitesthroughwho1.egenomeofcongenita1.microtiatoidentifytheirassociatedgenes.Todiscussthere1.ationshipbetweenabnorma1.methy1.ation1.eve1.ofgenesandtheetio1.ogyofcongenita1.microtia.MethodsToco1.1.ecttheresidua1.earcarti1.a

4、geof3patientswithmicrotiaastheresearchobject;norma1earcarti1.ageof3patientswithoutearma1.formationsascontro1.ChoosingNimb1.egcnCpGpromoterarraytoscreenthe28226CpGis1.andsinthewho1.egenomeofbothexperimenta1.groupandcontro1.group,thegeneswithdifferentia1.methy1.atedCpGis1.andswerese1.ected.Resu1.tsThe

5、rewerethirty-sixCpGis1.andswithdifferentia1.methy1.ated1eve1inwho1.egenomebetweenexperimenta1.groupandcontro1.group,inwhichtwenty-nineCpGis1.andswereconnectedwithtwenty-ninenamedgenes.Conc1.usionsTheDNmethy1.ationprofi1.eoftheentiregenomewasinitia1.1.yestab1.ished.The36abnorma1.methy1.atedCpGis1.and

6、s,inc1.udingtwenty-ninenamedgenesmight,re1.atetoIhepathogenesisofthedisease.Keywords:Microtia;DNAmethy1.ation;CpGis1.and。引言2025303540先天性小耳畸形是我国重要体表缺陷之一，国外报道的发生率为0.76/万4.34/万，我国为5.18/万1。先天性小耳畸形是由于胚胎时期第1鲍沟及其邻近的第1、2鲤弓的发育异常引起的一组颌面畸形，临床上常表现为耳廓畸形、外耳道闭锁和中耳畸形。小耳畸形病因尚不明确，在以往遗传因素、环境因素探讨基础上，以环境因素与细胞遗传物质交互作用的表观

7、遗传学探讨为其病因探讨供应了新的思路2。目前探讨最深化的表观遗传学机制是甲基化形式的遗传。DNA甲基化主要发生位点走CpG岛，大约50%的人类基因中含有CPG岛，常位于基因上游调控区的后动子区域，这些基因为管家基因或组织特异表达基因。启动子区的CpG岛通常处于非甲基化状态，CPG岛外（不在基因调整区内）的CpG位点常被甲基化。DNA甲基化是细胞开闭基因表达的一种方式，对生命过程特别重要，在基因表达调控、细胞增殖、分化、发育、基因组印记、DNA突变等方面都起着重要作用。目前探讨最多的是基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金资助课题（新老师20091106120052）作者简介：林琳，1976-

8、）,女，主治医师，先天性耳廓畸形病因探讨与治疗。E-mai1.:Iynn1.in_76ahoo-1-有关肿瘤方面，DNA甲基化变更常发生于肿痛形成过程，表现为整个基因组DN低甲基化、局部基因高甲基化。先天性小耳畸形患侧组织总体表现为颌面部发育不良，与肿痛组织45505560的过度增生呈相反趋势。本探讨拟对先天性小耳畸形的全基因组甲基化水F进行了检测，筛查异样甲基化的差异基因、CpG岛及其CpG位点，以探讨基因甲基化水平异样与先天性小耳畸形的发病关系。1资料和方法1.1探讨对象收集中国医学科学院整形外科医院术中废弃的先天性小耳畸形患者残耳软骨组织3例为试验对象，非耳畸形（耳外伤）患者耳软骨组织3

9、例为比照，与供者及其家属签订知情同意书。6例样本中，男5例，女1例，年龄626岁，平均（1610）岁。其中先天性小耳畸形患者3例，男2例，女1例：非耳畸形患者3例，均为男性。1.2主要仪器设备NinIbIeGenCpGpromoter芯片（美国罗氏Nimb1.eGen公司上海康成生物工程有限公司供应），非接触密闭式超声波核酸断裂器（比利时Diagenode公司）、芯片杂交仪（美国BioMicroSystems公司）,GenePiX400OB芯片扫描仪（冷泉港生物科技股份有限公司），SpeedVac离心浓缩系统（美国ThermoFisherScientific公司）、Nimb1.eChipMix

10、er（美国Nimb1.eGen公司）Nimb1.eScan软件（美国Nimb1.eGen公司）、Signa1.Map软件（美国Nimb1.eGen公司）。1.3试验方法标本取材1.3.1标本入选条件:切取的软骨组织量大于100mg;切取的软骨组织其四周软骨膜及其65皮下组织量少于软骨量的10%：选取的先天性小耳畸形患者为最常见的II度畸形：选取的耳缺损患者均为外伤且患耳无感染及软骨炎征象，视为正常耳软骨。取材后IOmin内将软骨组织于液氮中保存，无菌操作。制备CPGpromoter芯片1.3.2提取软骨组织DN,首先将基因组INA利用超声打断成400500bpDNA片段，将其7075加热变性并

11、将变性后的单链DNA样品分成2份：其中一份单链DNA样品加入抗5-甲基化胞朦沔定核甘抗体，运用免疫磁珠法分别样品中甲基化DN片段的抗体复合物，样品中其余的非甲基化DNA片段被洗脱，得到纯化免疫共沉淀的DNA片段(Methy1.atedDNAImmunoprecipitationSequencingMeDIP)：另一份单链DNA样品为不进行免疫沉淀的样品(乂称InPUI样品。对MeD1.P与InPUt样品进行扩增：将MeDIp(Cy5)与InPUt(Cy3)样品分别进行荧光标记后,将MeD1.P与Input样品混合、变性，与DNA微阵列芯片杂交。扫描和分析1.3.3用GenePix4000B芯片

12、扫描仪对CpGpromoter芯片的试验组3例和比照组3例样本的基因组DNA进行全基因组28226个CPG岛扫描，用高解析度芯片扫描仪检测杂交信号并输出影像，应用GenePixPro6.0软件提取数据并输出exce1.表格。依据其中一组全部高甲基化而80另一组全部低甲基化的标准筛选，确定2组之间存在CpG岛甲基化水平差异的基因。-2-序号CpG岛正常比照患者样本基因名称123456789101112131415161718192021222324252627282930313233343536chr1.9:3498928-3499339chr21:45719244-45720740chr1.:

13、8008141-8009441chr2:238812331-238814639chr1.9:4494407-4495578chr2:105864219-105865009chr3:144163824-144165955chr1.5:99846383-99848131ChrY:22082427-22082725chrY:22958786-22959083chr2:87022684-87023814ChrI9:43264488-43265592chr3:46766865-46767522chrY:9295830-9296350chr1.random:343347-343805chr3:185217

14、681-185218794chr20:59781493-59781823chr20:62032989-62033306chr3:75803981-75804596chr1.1:2774563-2774957chr19:55405442-55405885chr1.9:50786174-50786951chr5:140243269-140244338chr7:555439-556070chrY:22473488-22473786chr7:149699689-149700984chr4:170427932-170429419chr2:94900923-94901537chr1.7:7697297-7

15、698377chrX:136475192-136477844chr1.:133945477-133945810chr1.5:75897896-75899908chr!7:78522351-78522643chr1.9:14134429-14135173chr6:111073704-111074516chr7:583087-583372BCC5C19orf71C)H4COIJ8A1DNAJC5ERRFI1.ERG2CHES6KCNQ1.1.RG1.MYH14NCK20P3PAQR9PCDHA13PCSK6PRKAR1BRBMYIA1.RBMY1.BRBMY1.JREPIN1.RGPD1.SH3R11SIP11.3TEKT4TESSP5TMEM88TSPY3ZIC3结果2.1将Cy3和Cy5标记好的富集和未富集的6个混合样品DNA分别与甲基化基因芯片杂交。芯片扫描结果，对于某一点的信号,假如Cy3信号较强，该点多显绿色，呈高甲基化趋势;假如Cy5信号较强，该点多显红色，呈低甲基化趋势：假如强度相像，即显黄色。859095两种荧光分布匀称，片基无污染。2.2 对比试验组与比照组软骨组织甲基化芯片杂交结果，依据其中一组全部