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1、ICS11.040.30CCSC30T/CSBM团体标准T/CSBM0050.12024创面修复材料有效性评价第1部分：水溶性材料体外评价方法Effectivenesseva1.uationofwoundrepairmateria1.sPart1:1.nvitroeva1.uationmethodforwaterso1.ub1.emateria1.s况H（三）I实K2024-05-14发布中国生物材料学会发布T/CSBM“60.12024目次前三弓7，I”，M1.IHII1蒐的!.!.I2规范性引用文件13术语和定义I4细胞毒性试验15细胞增殖试验36细胞移，！5参考文献7本文件按照GB,b1

2、.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草.本文件是17CSBM0050-2024K创面修史材料有效性评价3的第1部分.包括以下部分： 第1韶分：水溶性材料体外评价方法： 第2制分：水不溶性材料体外没提液评价方法： 第3部分：刺激因了屏蔽评价方法： 第4部分：体外微血管形成试检评价方法： 笫5部分：体外细胞粘附和增殖直接接触评价法： 第6部分：动物食管创面模里促修史愈合评价方法： 第7部分：动物局创面模型促修复愈合评价方法： 第8陆分：动物肠道创面模型促假发愈合评价方法： 第9都分：动物皮肤创面模型促修复愈合质敢评价方法.请注意本文件的某些内容可施涉及专利.本文

3、件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由中国生物材料学会提出。本文件由中国生物材料学会团体标准化技术委员会归口.木文件起草单位：杭州英健牛物科技有限公司、中国食品药品检定研究院、四川大学。本文件主要起草人：戴建英、韩倩借、梁洁、高欣怡、于株杰、高洁、王涵、徐矗、邹文、王春仁、孔祥东。早期的创面愈合材料为普通无菌的敷料,主要起到物理1.禺保护创面的作用.随着生物材料的不阍发展.具行组织再生能力的材料不断出现.这些材料不仅具有保护创面.而且具有促进创面细胞再生迁修，加速创面愈合速收和提高创面愈合质量的作用.目前评价创面材料的有效性主要是讨价对细曲的隔离作用，尚无从细胞水平评价材料促进创面愈合的方

4、法。创面修发材料主要包括水溶性材料和非水溶性材料。本文件主要是针对水溶性生物材料,例如海藻酸钠、放甲基壳聚糖、胶原蛋白、透明肝酸钠等生物材料，聚刖体外细胞培养的方法评价材料对细胞增电和迁移的影响，确定材料促进细胞增殖和迂移的有效应水溶性生物材料主要是合成或天然高分子材料，有中性高分子、阴离子性高分子、阳离子性高分子和两性高分子材料以及其它无机材料，由于这些高分子材料在水溶液中的状态随舒浓度的改变以及溶液中反离子的相互作用以及分子量的不同等而呈现为不同的物理状态，因此也会表现出不同的生物活性。研究表明这类生物材料在溶解状态时的生物作用不是K1.者浓度的增加作用增强.因此彳!必要确定这些材料最佳的

5、细施增殖和细胞迁移的行效浓度.在此基础上研究材料的倪进细胞增殖和迁移的作用.确定材料是否具有促进细陋增殖和迁移的效果.创面修复材料有效性评价第1部分：水溶性材料体外评价方法1M本文件规定CK溶性创面修身材料体外评价的细胞谨性试验、细胞增班试脍和细胞迁移试验.本文件适用于适用于水溶性创面修发生物材料促进细胞增殖和迂移效果的评价.2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注FI期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GBJT16886.52017医疗器械牛.初学评价第5部分：体外细胞毒性

6、试脸3 *三X卜列术语和定义适用于本文件.3.1水溶性材料waterso1.ub1.emateria1.强亲水性的生物材料,能溶解于水中形成水溶液9戈均匀分散体系。如泡辣酸钠、竣甲基壳聚糖、胶原蛋白等.3.2ce1.1.Pro1.ifcraticn细胞生长和分裂产生两个子细胞的过程,导致细胞数地呈指数增长,是组纵修更过程中的主要机制.3.3细胞迁移ce1.1.Bigration细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的浓度梯度后而产生的移动.在这一过程中，细胞不断中织着向前方伸出突足，然后牵拉胞体的循环过程。来源:WT0606.202014,3,344.1 原理将待测生物材料溶解在培养基中，配成不

7、同梯度浓度的样品.按照GRT1688652017确定不同浓度下材料是否具有细胞毒性.4.2 A、细KM4.2.1 具试验器具如S：a）二氧化碳细胞培养箱：恒温水浴摇床：高压蒸汽灭曲锅：时胜荧光显微豌：细胞计数仪：恒温水浴摇床：僧标仪：电子天平：液斌找：j）冷冻离心机：W96孔板；I）细胞培养精或细胞培养皿.4.2.2 试剂和耗材试验读剂和耗材如下：a）含10%新生胎牛血清DMEM低糖培养基（含小FBSDMEM低或培养基）;b）二甲基亚飒（DMSO）;C）异丙酹：d）高密度聚乙烯.4.2.3 细胞系1.929细胞.13WAM4.3.1准确称取样品溶解在含10FBSDMEM低期培养基中，配置成不同

8、梯度浓度的样品，过/除菌低阻保存备用，根据样品现有的细胞毒性数据，配置10个不同悌度浓度的试验样品.，4.12阴性对Im计算直径为1Cn1.的高密度聚乙烯双面的面积,按3cnAM加入含I（MBSDMEM低轴培养基，37。120Iymin插床中没提24h.取浸提液使用，4.13取适量DMSO加入含10FBSDMEM低糖培养基内,制备IoSDMSo溶液,37。120疝面摇床中凝荡24h=13.4空白对Ji含IOUBSDMEM低犍培养基，37,120Mnin摇床中震荡24Iu4.4故3方法按照GBb16886.52W7中附录C规定的Mr咖的海性试验方法进行，处理条件、检冽模型、观察时间按表1进行.试

9、验设置空白对照组、阴性对照组、阳性对照组，试验组,籽个试验组设置6个复孔.将复苏好的成纤锦细胞传至两代以上呈对数生长期时，按照IX1.oS个Zm1.密度制备细胭悬液，每孔加入100uUW胞悬液.然后接科，到96孔板内,放入二氧化碳细胞培养箱在37C卜.培养2h移去旧培养基,按照试验设置加入对应培养液，继续培养2,Ih后，在显微慢下观察每组细胞形态，弃去每组培养液后加入1mgm1.501.MTT溶液，放入细胞培养箱中孵ff2h后弃去孵育液.加入100U1.异丙也用振荡器上振荡使蓝紫色结晶充分溶解混匀，在舱标仪上检测57Onm和65Onm波长的吸光馁值并按照式（D计算细胞存活率。1Iaf1.Mtt

10、试Ift试验分俎处理条件试找模型观察时何试4方法空向对照出含IOVBSInIw1.低务.培萍用成纤雉细胞（1.929）37CSOi共培养24hM口法阴性对照机裾变度!K乙痂含IoWBSDwHM低的第汴珞阳性对照纲IO）MSO含10、FBSIMN低摊培养柒武收姐不同诙境择品溶液P.打1.01.i.-（）式中：R细胞相对存活率，%:A570m一I列性对照组在57Onm处的干均吸光度：A6531P1.性时照组在60nm处的平均吸光度：Bmnm阳性对照组在570m】处的平均吸光度：B50m一阳性对照组在65Onm处的平均吸光明4.5试用祥品浓度的确定根据细恤毒性试脸结果，选择无细胞而性的高、中、低3个

11、浓度用于细胞增殖和迂移试验.若试验结果的细胞毒性在最高浓度或最低浓度表现为细胞增的率为最大值，宜进一步增加浓江或降低浓度由新进行细胞毒性试验.5W三tftt5.1 JKa在无血清培养基条件下测定细胞烟殖的情况，以无血清培养基为空白对照，含血清培养基为阳性对照。若材料具有促进细胞增殖的作用，则和空白对照相比具有明显细胞增殖反应，5.2 试OmhiM（5.2.1 具BJ4.2.1.5.2.2 试剂和耗材试脸试剂和耗材如E：a）含10%新生胎牛血清DMEM低搐培养基（含ISiFBSDMEM低糖培养培）：b）无血清培养基：cXCK-8试剂.5.2.3 细腿系5.2.3.1 试验可使用的细胞系如下：a）

12、成纤维细胞；b）皮肤.上皮细胞；c）住管上皮细胞：d）用黏膜上皮细也：O肠黏腴上皮细胞.5.2.3.2 对用J不同部位的修IX材料选朴合适的钿胆系，如用于皮肤的修用材料可用皮肤钿胸,用于食管的材料可选择食管上皮细究.5.3样品制备5.3，试验样品按照细胞毒性试的确认的3个浓度称取样品溶解在无血清培养葩中，完全溶解过滤除阑备用.1.1.2 阳性对照含Io1.UUSDMEM低糠培养基，37120rmin播床中震荡24h,1.1.3 空白对照无血清培养基,37，、120r/min摇床中震荡24h5.4 试脸方法将在对数生长期内的细也按煦1X10,个/m1.的细胞密度加入到96孔板内，每孔1001.,

13、6个史孔。在细胞培养箱中培养24h后弄去I1.1.培养施，按照表2煨定加入对照殂和试会抓溶液.于24h、48h和72h分别观察细胞增殖情况,弃去孔内液体,加入CeK-8溶液,放入培羿箱内再育3h.孵仃结束使用陆标仪测fit450nm的吸光度值,按照式（2）计算细Ift增班率，评估试验样品溶液不同浓度对细胞的增殖作用,并筑选出段佳增殖浓度.表2细胞增殖试验试验分组培养条件口测模型观察时间检抬方法阳性对照组含IOVBSDMEM低物培养基细胞系24Ik48h.72hCCK-8法空白对照组无血法培养基试验也样储无血清培养刘溶液p2B三a1oo.式中：P细胞增船率.%;A450m一一阳性对照组不同浓度样

14、品组平均吸光度：B45Ctan空白对照组平均吸光度.5.5 结果分析考文1.YY0606.20-2014组织工程医疗产品第20部分：评价基质及支架免疫反应的试验方法：细胞迁移试脱I2GBT16886.12-2023医疗械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品3杨敏一，王涵，普行，等.理子温度双敏感型拈膜创面保护股性能及拈膜修更有效性体外评价研加J.北京生物僵学工程，2022,4M(M):405-412.(4HangZ1.MUyeH,MinyiY,e1.a1.InVitroandInVivoInvestigationontheEffectiveness“A1.ginate-BasedGas1.ricmkomiProtectiveGe1.UJ.BioMed“加小intcrnatina1.,2022,20228287163-8287163.