DB50_T 1607-2024 水生动物细菌性病原菌耐药检测技术规范.docx

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1、ICS66.150CCSK52DB50方标准DB50.T16072024水生动物细菌性病原菌耐药检测技术规范202407-08发布202H(HB实施咻市市场监督管理局发布本文件按照GB，T1.1-2020标准化I：作导则第1陆分：标准化文件的结构和起草规1!必的规定起草。本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的出任.本文件由重庆市水产技术推广总站提出.本文件由亶庆市农业农H委员会归口并组织实施.本文件起草单位：重庆市水产技术推广总站、中国水产科学研九院长江水产研究所、西向大学、重庆市水产学会.本文件主要起草人：张利平、王波陈波、李虹、梅会消、很旭亮,IsJ雨华、周明、朱成

2、科、卓东波、冯俊、薛明洋、薛洋、馀风、廿娉岬、吴晓清、周春龙、刘晓将、何也iff.水生动物细菌性病原菌耐药检测技术规范1 9本文件规定了水生动物细的性病原的耐药检测的试剂、仪器设备、药版实缝、结果判定、无H化处理和质原澈实验室生物安全等技术要求。本文件适用于水生动物细曲性标原耐药检测.2 IK范性引用文件下列丈件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款,其中，注11期的引用文件，仅该日期对应的成本适用于本文件：不注日期的引用文件,其最新版本（包括所有的偿改单）适用于本文件。GB,6682分析实5金室用水规格和试5金方法SC/T7015病死水生动物及病有水生动物产品无杏化处理规范S

3、CvT7028水产养殖动物细面耐药性调伐规危通则SC/T7201.1鱼类细崩性病检疫技术规程第1部分：通用技术WS233病原微生物实验室生物安全通用准则岭/T639抗菌药物收雄性试验的技术要求3 和8和定义下列术谙和定义适用于本文件.3.1任抻浓度MiniBa1.inhibitoryconcentration;MIC在药物根感性检测实验中能抑制肉眼可见澈生物生长的最低抗胸药物浓阳3.2WBSusceptib1.eS当抗阳药物对分离株的M1.C处于版聘范的时，使用推荐剂用进行治疗，该药在感染部位通常达到的浓度可抑制被测阳的生长，临床治疗可能有效。3.3耽（ResistantjR当抗菌药物对分离株

4、的M1.C处于该分类范围时,该药物浓度不能抑制细阳的生长，H1.（或）被测黄株获得特殊耐药机制，（&床治疗效果不佳.4试剂3.4 W实验用水、Naa、脑心祝液肉汤、脑心浸液琼脂培养基。试剂配制应符合附录A的规定.实验用水应符合GBJT6682中一缴水的规定.4.2 就材%11药敏板，-V-型加样楠（31rF5）e5仪设备超净工作台、生物安全柜、医用冰箱.高压灭菌祸、生化培养箱、麦氏浊度仪、移液器.6MKtt6.1 单）-6.1.1 招已鉴定的病原菌在脑心浸液琼脂平板（或者选用已知的适宜培养基）上进行平板划线，28C2C培养16h-24ho6.1.2 待测曲株应为单曲落.单菌落的制备可参考SC/

5、T7201.I中分离和纯培养方法进行。.2W*三M*无葡棉签排收单个雨落于5m1.无菌生理盐水的比油,管中混匀,麦氏浊度仪测!也使其达到0.5麦氏单位浓度的曲悬液,标记为A管.翻悬液应在15min内使用。6.396扎药（板加律6.3.1取1支10m1.的无菌脑心浸液肉汤,以无菌操作方式向空白对照孔中分别加入100U1.无菌脑心浸液肉汤，63.2另取一支10m1.的无菌脑心浸液肉汤，从A管中吸取200U1.菌悬液加入到其中，记为B管.1.1.3 将B管中菌液混匀后倒入无菌V”型槽内.1.1.4 利用将液台吸取“V”型槽内的由液，加入到所有微孔中（空白对照除外）,每孔1001.空白对照孔总后加入1

6、00Ii1.无常生理盐水，96孔药政板所用药物及茜物浓度见附录B,1.1.5 招加样后的96孔药敏板放置于28C2C生化培养箱中培养24h-48h后读取结果。6.4 tt若阴性对照孔底浑浊或阳性对照孔澄明,则此次试验无效.重新进行实验.若用性对照孔底澄明.阳性对黑孔泮浊，则与阳性对照孔比较，孔底内液体浑浊则为阳性（+）：孔底内液体澄明，则为阴性（一）.孔内抑制肉眼可见微生物生长的最低抗菌药物浓度为MIC当由现单一跳孔时,应记录抑制细南生长的鼓高药物浓度。结果读取参考附录C96孔筠收板结果参考图.6.5标准赭株宜为大肠埃希1（ATCC25922）.标掂前株药故实验同步骤6.I6.4现定方法进行.

7、7结果R定对照受试曲的M1.C依据SGT7028中规定要求将雨株判定为地感（$）、中介或酎药（R）.8无害化处理实验过程中所用的网顼、耗材及产物均阁要经过121C.15min而乐灭前后.方可处置一9生修安全防妒实验人员必须穿在合适的实验服佩敢好口跟、帽子及一次性手套.进行活体处理或接触含有微生物的物品后.要洗手,离开实验室前要脱掉手套，次性手套不得清洗和再次使用.如果发生污染性物顷溢出等事故，应及时向实验室倒我人报告,并记录羟过和处理方案.禁止在实会堂饮食、吸烟、化妆和储存食物，非工作人员禁止进入实险室,WA(范性)A.1火生理总水A.1.1配方NaCI8.5g水I(XWm1.A.1.2EM混

8、匀，121C商压灭酸15min,备用。A.2超浸电(BHI)肉潮A.2.1M脑心浸液肉汤培养基50.0g水100om1.A.2.2EM混匀，加热使之完全溶解，用1BO1/1.的WOH或HCI调饰H,使灭茵后为7.27.4分装烧植，匕SJf1.i灭菌15min.4C保存备用.A.3JNK屈液(M)琼平板A.3.1配方陋浸液琼脂培养基24.5g水100om1.A.3.2EM混匀，加热使之完全溶解，用1BO1/1.的NaOH或KI调节pH,使灭幽后为7.27.40分装烧瓶，121C,高乐灭菌15min.冷却至50C左右.制成平板.4C保存备用.附录B(资料性)96孔板药敏板的制备8.1 试剂和材料8

9、.1.1 抗菌药物标准品恩诺沙里、质酸新和素、甲IM用素、辄笨尼考、款酸多西讣素、氟甲咬、磷胺间甲冢理唯的、磺胺甲唠哇甲氧节城B. 1.2溶剂与稀释剂各药物的溶剂。稀稀剂见表BI.试验用水应符合GB/T6682中三级水的要求表B.I杭曲药物储缶漉所用的溶剂和稀释剂药物名称M台液浓收Ug111.溶剂稀仰剂恩诺沙里1001/2体枳的水和烛小浓度为2.5m1./1.30H至洛加水硫酸弱掰率2500水水甲破一甲5120QIN二甲基甲帙眩溶液水鼠惹尼考512095乙分水款酸多西环素12KO水水H1.1.t25601/2体枳的水和以小浓度为2.531，1.粕OH至济*水Ht胺间甲敏眈吱钠102401/2体

10、枳的水和域小浓度为2.Mn1./USm1.至洛的水成IK甲吃H(HWO1/2体积的水和火小浓境为2.Sn()1.Xa(MIt?水甲辄莘位3200.05no1.fi极或世检，修体枳的10%水注】：亚方药物先也牧配置与林存做药物依5性试验时,内技1:1等体枳混合使用.注2：恩诺沙星为21类时,溶剂为水.注3:若药物在所析出,租itt温热使共溶斛,B.I.3抗曲药物稀稀取灭菌的BH1.肉汤，在无菌96孔板的第1孔加入160U1.在第2孔至第I。孔中分别加入Ioc1.M1.。在第1孔中加入抗制药储备液40M1.吹打混匀；取第I孔中的含药肉汤100P1.至第2孔中吹打混匀：吸取第2孔中的100U1.含妁

11、肉汤至第3孔中吹打混匀,里发上述操作.物为物进行2倍梯度稀降.当第12孔稀狎先后吸出100U1.含药肉汤弃去，使含有药物的BH1.肉汤每一孔均为1001.其中坐标Gi1.、GI2、H1.hH12.I100U1.BH1.肉汤,作为阳性对照孔和阴性对照孔，药坡板药物及药物浓度见表B.2。*b.2ImK药物及药肱度药物名称浓度（ug/面.123456789)01112A恩诺沏S168420.50.250.1250.060.030.0150.008B破酸新霉素25612832168420.50.250.125C甲飒霉米51225612861321684210.50.25D坎米尼考51225612864

12、321684210.50.25E盐酸多西环素1286432168420.50.250.1250.()6F寂甲哇25612864321.8420.50.250.125G礴战何甲辄理喧蝌1024512256128643216842阳性对照阳性对照H横股甲I喋+甲氯羊睫608/32304/16152/876/438/219/19.5/0.5.*0.252.4/0.121.270.06阴性对照阴性对照就就嗣斛匐*战*：仓C. 196孔药敏板结果参考图见图C.1。同亨;，；,缄Q息蔻境X，：，：宣鱼冤冤冤塞嵬寒0:j.税痛冤冤&黝寡:克：富勖寒泌溶：:胤：穹遇玛德演0:厩就第*：*局部幺0:贰，施加寒微膏就就脸b穹觞意意篱M1.CBBe1.96孔药*慝结果Hff1.