饲料原料 酵母水解物和酿酒酵母 细胞壁中甘露聚糖的测定.docx

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1、中华人民共和国农业行业标准饲料原料酵母水解物和酿酒酵母细胞壁中甘露聚糖的测定编制说明中国农业科学院饲料研究所2023年09月目录一、标准制定背景及任务来源31.1 标准制定背景31.2 任务来源41.3起草单位4二、主妾工作过程4三、标准纸制摩则和主要技术内容确定的依据53. 1标准编制原刖54. 2标准主要技术内容确!定的依据5四,标准制定的主妾内容与其依据55. 1色遨分析条件的确定54 2水解条件的隔定743单糖与多雅糖的换算844方法学考察845标准适用苑园185 .6结论18五、采用国际标准和国外标准的程度18六、与有关的现行法律、法规和强SM性标准的关系18七重大分歧意见的处理经过

2、和依据18八、本标准作为强制性或推荐性标准的意见18九、贯彻标准的要求和指Sfe建议18十、废止现行有关标准的建议19十一、其他应予说明的事项，19饲料原料静母水解物和修酒醉母细胞壁中甘雷聚糖的测定编制说明一标准制定背景及任务来源11标准制定背景1.1.1制定该项标准的目的和意义我国股消M1.母资源丰富.2008年废弃的的酒常母有82.06万吨.因此,近年来酵母源惘料产品的开发成为市场热点,引发了不少生产企业的加入,涉及的产品包括饵用酵母、服酒酵母培笄物、酵母水解物、醉母细胞壁等.2013年12月，国家农业部发布公告,正式将极酒酵母细胞壁、酿酒酵母培养物、醉毋水解物等加入饲料原料目录，并强制性

3、要求其标识中必须有甘福聚糖的含量,甘露聚糖是的酒醉母细胞壁中最主要的生物活性成分，具有提裔免疫力；抑制肿胸发生、抗舄i射、抗笈化；并且其对霉南毒素具有较强的吸附能力。由于的酒醉母甘露聚糖具有同时吸附多种毒陆毒素的能力，添加依低H有效,而且在胃肠道内稔定性高，排出后可以被降耕等特点,使熊酒酵母细胞壁等产品成为一类非常有阀景的再值毒素吸附剂产品，而其中甘羯聚他的分子量及含量是衡量此类产品有效性的重要指标。为锥护广大用户的利益、提高产品质豉，开发相应好露聚穗的检测方法对眼消酵母及其加工产品进行检测.建立相附的检测标准势在必行.通过本标准的制定,可填补限酒酵母及其加工产品中主要功效成分甘露聚桶含*没有

4、相关标准检测方法的空白，为确保该产品炭信安全提供快速有效的检测方法,对保Mi饲料产品质W和吊产品安全的工作都具有曳要意义，112国内外方法的研究概况饲科僚件目录中描述“根消酵母细胞照”为：曲酒醉母羟液体发酵后得到的菌体，再经自溶或外源陋催化水解.或机械破碎后.分离获得的细胞壁浓缩、干燥得到的产品：“储用水解物”为：以旭泗酵母为菌种,经液体发酵得到的菌体,经自溶或外源陆伟化水解后,未经提取可溶物浓缩干燥后的产品.强制性标识要求中均行甘乐聚福的标识要求.然而,根酒酵母细胞壁及MI用水解物产品中甘糊聚精的检测方法至今仍未制定.目前，国内外仍无测定酵璟及其加工产品中甘/聚桶的标准方法.雷见的甘然聚精测

5、定方法有比色法、再法及酸水解法等.其中比色法只要化合物具备糖结构就能被比色法检测因此选择性太差：离法则分析髭时长且搽作繁地重复性差，甘露聚糖在无机酸作用下能完全水好.定展地转化成相应的总能，因此,将甘露聚搐通过酸水解汨到甘假糖后再进行检测,以终换算料到ifi聚低含量是目前应用最多的方法.水解后甘露糖的测定方法主要有高效液相色谱法和离子色谱法C.高效液和色诰法渊定样品中的甘寤糖可用脩分析柱和城基键合相柱，此法操作便捷，通用性强，在生产企业中应用广泛，但所用示差折光检测器,响应位小、选择性较差、足限度较低.还将将酸水解后单楠需要势过柱前或柱后衍生化用反相高效液相色谱进行分岗，利用紫外或受光检测器进

6、行检洌，羟过衍生化后，取助的分点选择性和检测灵敏度都得到增强小.但是分析耗时长口操作繁顼.近年来，利用离子色谜法和脉冲安培带测器对水解后的单期进行测定的方法在国内外得到了广泛应用，该方法具有方便快速、灵敏度离，选择性强等特点，该方法在专业检溺机构中应用较多。1.2 任务来源般酒酵母及其加工产品中甘语聚期的测定是由全国饲料工业标准化技术委员会下达的检测方法标准制定任务，行业标准项目编号为2213010930261000。1.3 起草单位任务下达时，制定该标准的起草埴位为中国农业科学院饲料研究所.在标准制定过程中专家建议参照已发布的行业标准NYT34772019饲料原料根消常母细胞壁,补充生产企业

7、枭用较多的液相色诺检测的相关内容，因此邀请安琪解母股份有限公司作为共同起草单位。二主要工作过程方案制定：标准编制工作小组广泛收集国内标准、国际标准和国外先进标准中的相关标准,并检索了有关甘露聚精检测方法的国内外文舔.球樨了当前I1.常聚糖含量分析现状.制定了标准检测方法试脸草案，拟订工作计划和工作进度.方法立：按照拟定的试5金草案,确定具体的检测分析步骤.进行相应指标分析、数据聚集。并进行比对分析，筛选G佳的样品制备、酸水价、肉子色谱方法的仪器分析等条件。并进行了线性、检测限和定量限、添加回收率等相关试脸以确定方法最终是否具有可操作性和科学性。标准与I编制工作小组在方法实验过程中认式学习了GB

8、T1.J-2009标准化工作导则关于“标准的结构和编目”,GBT20001.4“化学分析方法”等有关知识，弄清了化学分折方法的编写现期.在12月初完成了该方法标准的征求意见稿和编制说明。征求意见稿的方法名称为酒醉母及其加工产品中甘赤蜃糖的测定3。方法险证，邀请河南省兽药饲料监察所.国家饲料质优监督检验中心北京,北京市饲科赛察所等二家单位参加实验室比对工作，以脸证和确定离子色诣检测方法的精密度.征求意见：向包括第三方检测机构3家，饲料企业及薛母产品生产企业4家，各省部级饲料监察部门等共计15.家单位发送了征求意见稿3,【可函并有意见或建议的单位15家：收回了15家20位专家填好的征求意见非20份

9、，提出意见共98项，果纳72攻，部分采纳7项,详情见征求意见汇总表,我们根据专家意见做了相应修改，补充了一些实5,完善了标准内容,形成标准预审稿.标宸初审2020年I1.月我们趣请8位专嚓时本标准进行了预审,针对参会专家们提出是群母细胞壁中可能含有的总触：1单箱一般属于弱酸，因而在PH12以上的淋洗液中就可以部分或者全部以阴离子形式存在，同时由于糖类物质都具有电化学活性状团，而使得脉冲安培检测落成为离子色谱仪测定曲类物旗的最常见检测器，参考歌安公司提供的单他分析参考方法,阴离子交换分离柱PAIo和PA20均可用于分离棚醉.单曲和双轴，虽然在李仁叶,和李国强”等的论文里,都选用/CarboPac

10、PA1.O,但是本研究经过对这两种分析对付需糖等四种目标物的分肉进行比较时发现Cartx5PacPAIo柱容料较高但分析时间过长,且对甘露就和木嬉的分肉效果欠佳.而CarboPacPA20虽然柱容成收低,但本研究样品中所含行的各种单掠都可以褥到有效的分离.因此最终选取CarbOPaCPa20色谱柱用干本方法的建立.经过多次淋洗条件优化，发现NaoH浓度为4mmo1./1.时这几种单独的分离度较离，特别是偏筠糖利甘露筋得到了有效的分成.分离情况如图1所示.目标物分离后，为了确保色讲柱上没有杂质残用,再利川60mmo1.的NaoH冲洗6分钟和利用4mmo1./1.的NaOH冲洗9分钟iS行再生，从

11、而保护色谱柱和保证结果的立现性.通过以上研究，本标准以终确定的色谱条件如下：色谱柱：阴离子交换柱(PROD.CO1.CPPA20,或能力相当者柱长15Omm内径3.()mm；流动相：超纯水（八）,2(XmmNaOII溶液(B)(流动相的梯度变化程序为0min(2%B.15min(2%B).15.0Imim30%B)21mn(3O%).21.01min(2%B.30min(2%B)流速：CUOm1.Jmin,柱温：30C,进样W251.,；：二立AAAA囱丽单朝.而燕的离蒋黄函77Ug,11F41.2液相色谱色谱条件的现定液相色谱为参照引用农业行业标准NY3477-2019中的检测方法,该方法采

12、用了AminCXHPX-87H色谱柱进行水解后通枪的分离.该柱由聚米乙烯二乙循生树淅城装而成.对于单精分离，配基交换是其主要分离机制，样品中糖的羟基与树脂的固定抗衡高子的结令,然后通过离子调节分配层析技术进行分离.与其他的糖分析柱相比,AminCX柱的优点是样品无需进行衍生化,制爵工作极少.具备拓庆枪定性，宽PH枪定性以及高柱效和选择性.据ChinniCi等报道Am1.nCXHPXMH色谱柱可以果川HM)或HSO,为流动相对行机酸和糖类组分进行分析.经比较本方法选用HfO,作为流动相，在对样茄的分总条件进行选择时.比较发现柱温较低时,）而疑与甘露糖较难实现分黑.柱温达到65C时.简药的与甘聚鞘

13、基本实现分离，30Omm长柱可在20分钟内分离水解后样品中如砂棚和甘露鞘的混合物，分离情况如图2所示.因此.本方法最终确定的色谱条件如下：色谱柱:minexHPX87HionExc1.usion（7.8mm300nunBIO-RAD.或能力相当者：流动相：硫酸溶液0.005no1.1.）；检测器:示差折光检测器：柱温:65C；流速：OSm1.hiin:进样出：201.图2甘需柚和他箱糖标准溶液（100QuftZm1.）的液相色谱图4. 2水解条件的确定有文献报道的用于低聚糖水解的无机酸主要为硫酸和盐酸，我们分别对利用72%H6OM37%HCI水解样品中的H喇聚樵进行了研储利用M堤源的H掰聚精（

14、CAS号9036-88-8,纯度299.9%为标准对样从，时水裤温度、酸的加入m以及水解时间：.个主要因索进行考察.最终确定硫酸的最住水解条件是向样M中加入3.3m1.的72%H64,浸泡ih,在样品中纤维素、多糖容充分溶解后，再加入适收水。为了避免挥发酸对设;的屈蚀，需将水解后溶液转移至25Om1.水解械中，料水解瓶封口后放入制压灭曲锅中，在121IC卜处理2h后，甘乐娘铺的水解效率趋于梗定并达到最大值，而随着海度进一步升高和时间延长,甘露聚糖的回收率会随之下降.盐酸的最佳水斛条件是加入6.0m1.盐酸（37%）,在30C水浴中处理45mm,然后加入适量的水.在高JK灭菌忸中121T下处理I

15、h时甘箱黑糖的水解效率达到最大值.两种酸水解方法各有优法点，碎酸水解什施聚精的水解后甘联Itt的平均回收率为89.51.26%,盐酸水解后甘露期的平均回收率为86.12.01%,但是能酸水解的样品在上机前需加硫酸创沉淀硫酸根点子，操作时间较长且繁琐，因此我们以终选取了盐酸水解方法为前处理方法。具体方法见标准草案，4.3单绐与多聚糖的换算本研究的检测方法是利用甘寤聚鼬水解产生还原树而定聚翩的含量的，由于多桶水解后除末战轴塔外，其余驰班都多了一份水而形成电助，所以单助作为标准时，算出的多期含信都要扣除水解中帚进的水的麻,即要乘以一校正系数.此套数的计算方法如公式I所示.其中：180为单糖的分子fib18为水的分子麻，n为组成多糖的雎糖个数.I8r-I8x(-1)=II8O)研究表明股科博母多糖均为大分子多世,其中啤酒的分子量约为220kD.目前市售的部分酿酒酵母为原料的多糊产品虽然有屿是经过部分水解的，但也是20个单棚左右加成的买糖，即n约为201.(XX),按照以上公式计算出的系数约为0.9050.900,因此，本研究以终将该系数确定为09,和目前企业和检测机构中通用的系数一致.4. 4方法学考察4.1.1 标准品的线性范围a离子色谱法标准曲税系列溶液按照选定的仪器条件上机，以浓度为横坐标，峰面