乙型肝炎病毒相关性原发性肝癌患者前X基因的分子流行病学意义.docx

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1、乙型肝炎病毒相关性原发性肝癌患者前X基因的分子流行病学意义乙型肝炎病毒相关性原发性肝癌患者前X基因的分f流行病学意义乙型肝炎病毒相关性原发性肝癌患者前K基因的分子流行病学意义【摘要】目的：了解前X基因在HBV相关HCC患者中的流行病学分布、前X基因和HBV基因型与HCC的临床关系.方法：患有乙肝的肝细胞肝癌患者35例，采纳型特异性引物巢式聚合醐链反应进行基因分型.同时对明确基因分型的肝癌患者，扩增前X区，TA克隆到PMD18T载体后进行单克隆测序，分析前X区在肝癌患者的表达状况，对前海X区和基因型及相关病情进行探讨.结果三：HCC患者35例中B基因型1例，C基因型24例，B/C混合基因型8例，

2、在未定型者2例.明确基因型的患者33例琶，进一步扩增前X区，并经TA克隆获杳得93个单克隆株中，经测序表明，有6哧5个单克隆株编码前X多肽，占之H觞CC患者33例中有29例编码前X多海肽，编码率为乐高于慢性乙型肝炎患者孜治的编码率.C基因型前X多肽编码率铲为先,B/C混合型编码率为乐B基因洲型无编码.前X区的发达与年龄,性别敝,家族史，AFP,HBVDNA,A1.疤T水平间无关.结论：HCC患者中C基因型、B/C混合基因型较为多见.前X之间有确定相关性.【关键词】肝炎病毒乙型基因豚型前X基因癌肝细胞。引言乙型影肝炎病毒在其负链上含4个部分重登的开榻放读码框架即前S/S区、前C/C区、P区和X区

3、，分别编码7种性质不同的蛋慢白如HBcAg,HBeg.HBsAg等.有探讨表明，X区编码的HBXAg与肝细胞肝癌的形成亲密相关门.荡探讨证明，在XORF的上游还存在一个磔新的ORF即前XoRF2,而关于其的功能探讨尚不多见，是否具有类似族功能尚不确定，我们对前XORF功能三进行初步探讨.1对象和方法对象X战X01/XX12HBVDNA阳性乙的HCC患者35例.全部患者均经B超岫、CT和核磁共振或血管造影等临床诊断励为乙肝相关性肝癌，采纳蛋白酶K、酚饰氯仿异戊醇法提取血清HBVDNA.乙肝标记物(HBVM：HBsAg,研AntiHBs,HBeAg,Ant签iHBe,AntiHBc)的测定觎均采纳

4、E1.ISA法检测，试剂由华美生物工程有限公司供应.生化指标由我院全T自动生化检测仪常规测定.方法通过比对不同HBV基因型序列以及参考Nat魔io3等设计的6种主要基因型的分渥析方法，设计了共同的外引物P1.P2免，进行PCR扩增，并以扩增产物为模板沦进行基因型特异性内引物扩增.基因型特异性内引物犷增分为A,B两组，其中捆A组包括共有的上游引物P3,PA,PTB,PC(基因型C特异性下游引物),攸B组包括上游引物P4以及基因型D,E脓,F的特异性下游引物PD,PE,PF淫，同时行PCR扩增.取第2轮PCR扩腆增产物51.经过20g1.琼脂糖凝胶电泳后推断HBV基因型，依据电泳结果洼推断HBV基

5、因型.以35例HCC患街者中明确HBV基因分型的33例患者H管BVDNA溶液为模板，依据前X上游滞引物Px1.,下游引物为Px2,扩增前冰X区4.Px1.下游第3133陆nt处为前X区起始密码子ATG,P轻x2上游3032n1.处为X区起始密码子ATG,扩增的靶区域全长231n岐t,其中前X区全长为168n1.将澄PCR产物回收并连接至PMD18T舐载体，将连接好的重组体转入感受态细胞焙，经第羊青霉素和Xga1.蓝臼斑法初垂步筛选阳性菌落，进一步提取质粒采纳PCR法鉴定.对经过鉴定的胜利导入前呆X基因的菌落送测序.统计学处理：所有数据应用统计软件分析，不同组间率的格比较采纳2检验，均数比较采纳

6、t检验P2结果基因型应用该基因型分型方窥法，A组PCR产物电泳时基因型为6从8bp,B基因型为281bp,C基因缁型为122bp;B组电泳时D基因型为H9bp,E基因型为167bp,F拿基因型为67bp.本组的35例患者中橐，B基因型1例，C基因型24例，B/迳C混合基因型8例，未定型者2伊人未见龄其他基因型.前X基因PCR扩增扩增的靶区域全长231bp,胜利构建战出PMD18T前X载体后，以P银MD18T载体上游引物M13和PX争1为上游引物、Px2为共有的下游引物同时行PCR扩增，可得到308bp和锄231bp的片断，说明克隆胜利.前X基因序列分析经鉴定胜利导入重组体琳的菌落，随机共选取9

7、3株送测序.前桔XORF全长168bp,位于测序片断泊的第31位至第198位，依据其测序结师果推定核甘酸序列如下：TGGGGCnGGCTATTGGCCATCGHCCGCATGCGTGGAACCTT秦TGTGGctcctctgccgaTccatactgcggaactcc标TAGCAGCTTGTTTTGC榇cgcgccggtctggagcg#actttcggaccgc扪ctctgttGtcctctc盹Tcggaaatacacctcctt莓TCc：在这93个克隆中有65个克惹隆在第333bp处为ATG,而该款位点即为前X基因的起始位点，是胜利卡编码前X多肽的关键所在，占所测核甘酸序列的爷.而经过进一

8、步分析发觉，在漱前X基因全长168bp中未发觉终止顽密码子的出现，导致其余28个单克隆不柠能编码前X多肽的缘由在于该位点出现闪了AC替换突变，使其不能正常编码.钛前X多肽在HCC中的分布来自同一槿例患者的不同单克隆中，只要有一个单克沏隆可以编码前X多肽，就认为该患者可以表达前X基因.在来自已知基因分型镑的33例HCC患者，随机选取的93个解单克隆中，有65个克隆可以编码前X嬴多肽，分别来自29例患者；而在剩余的28个单克隆株中，有3个单克隆来自同嘤一患者，而相同的状况还出现在另外3个患者，即共有4例患者被认为不能胜利编求码前X多肽.前X基因分析在已知基因分型的33例患者中有B基因型1例敢，C基

9、因型24例，B/C混合型有8例.1例B基因型患者中3个单克隆株皆未B表达前X多肽、24例C基因型患者中+有50株乐8例B/C基因型患者有1之5株先能胜利编码前X多肽，即24例寞C基因型患者中有22例可以编码前X鸾区，约占先,8例B/C混合型患者有7愫例可以编码前X区，约占%.因B基因横型例数较少，仅对C基因型、B/C混合丽基因型进行分析，前X区在C基因型、B/C混合基因型中表达率无统计学差异居.与既往慢性乙型肝炎人群中做的前X竦基因调查结果相比较4,前X基因嬴在HeC患者中的表达率高于CHB人群幅，前X区在不同人群中分布有所不同，鸽在HCC人群中表达率较高.依据前X基因的表达与否将其分为2组，

10、探讨前X区与临床相关资料如年龄、性别、家族$1史、乙肝标记物、HBVDNA等之间的关系.表1前X基因在不同人群中的分布状况表2前X基因与年龄、家族史、醉性别的关系3探讨HCC的发生是一微个多基因、多途径的困难多阶段过程.H使BsAg阳性者进展为IICC的危急性比HBsAg阴性者增加了100倍以上.采目前对HBV长期感染导致HCC发生的窘具体机制尚不完全明确.自Takaha宝Shi等5于1995年探讨曾发觉前X区的存在外，近期有探讨证明前皴X区存在的确定性6,但关于前X基因的功能探讨较少7,为了更具体旅的了解前X基因在HCC患者中的表达状况，明确前X基因与HCC的发生有鹘无相关性，对进一步探讨前

11、X区的功能供应一个方向，我们以HBVDNA阳性桦的HCC患者为探讨对象，进行前X基郎因分子流行病学调查.本或验探讨结果表释明，在已知基因型的HBVDNA阳性的停HCC患者体内普遍表达前X基因，同时，经过比较，前X基因在HCC患者中表达率明显高于慢性乙型肝炎患者，具有显著性差异，说明在疾病的不同阶段，H其前X基因表达不相同，提示前X基莱因可能与HCC的发生亲密相关.此外，彦本探讨还提示应对慢性乙型肝炎表达前犬X的患者进行长期的动态视察，进一步明藜确前X基因与HBV所致的疾病不同状谄态的相关性.并且我们发觉，前X区主清要集中表现在C基因型，但是在B,C混香合型中也有较高的表达率，二者并无显著狡性差

12、异.由于我们所做的HCC患者中只摧有1例B基因型，虽未能表达前X基因阡，但不能解除样本量的影响.本试验表明桅前X区具有确定的基因型倾向性，但不超能确定是否具备基因型特异性.有探讨嗑表明年龄、性别的不同在乙型肝炎演化为半肝癌的过程中存在着明显的差异.但我们发觉，年龄、性别的不同在前X区的表达组与未表达组均无明显差异.从乙肝病藐毒熨制指标分析，无论是UBVDNA水平还是HBeAg阳性率.，前X区表达7组均高于未表达前X组的HCC患者，但均无显著性差异.前X表达的HCC-T患者在肝功能损害水平A1.T水平、AF挣P阳性率与未表达的前X区的HeC患奥者同样无明显差别.这些均说明前X区龄的表达与性别、年

13、龄等临床相关指标无明偏显关系，但尚不能解除样本量的关系，仍需进一步视察.我们的探讨表明，前哦X基因的编码在HCC患者中具有普遍性.这也就提示在HCC患者体内，可能还存在着一个始终未被探讨的蛋白即全X蛋腭白.而其与HCC发生、发展过程的关系佞或许比HBxAg更为紧密，对其功能及肝具体机制的探讨仍须要我们不断的深化.【参考文献】1TangH,OishiN,KanekoS,eta1.蹦.Mo1.ecu1.arfunctionSandbio1.ogica1.ro1.e廉sofhepatitisBvirus互XprotEinJ.Cancer维Sci,XX,97(10):977-奥983.2董菁，成军.乙

14、型肝炎铁病毒前X基因的初步探讨J.世界刈华人消化杂志，XX,11:1097-1101.3NaitoH,Ha给yashiS,AbeK.Rapida酵ndspeciFicgenotypi瘫ngsystemforhepatit云isBviFuscorrespond仝ingtosiXmajorgenot嫖YpesbyPCRusingtype颂specificprimerJ眯.C1.inMicrobio1.,200瑚1,39(1):362-364.4董普,杨倩，成军.乙型肝炎病毒基因组前X区的分子流行病学探讨J.世界华人消化杂志，XX,12：42戳-46.5TakahashiK蹇,KishimotoS,

15、OhoriK蜉，eta1.Auniquesetof稼mutationsinthepre团XregionofhepatitiIfSBvirusDNAfrequent行Iyfoundinpatientsb蒯Utnotinasymptomaticcarriers:imp1.icationforanove1variantJ.IntHepato1.Coinmun,1995,3:131-138筠.6董菁，成军，杨倩.乙型肝炎季病毒新开发读码框架的确定及其意义IJ擦.世界华人消化杂志，XX,12：757-762.7薛红安，杨倩，彭刘拉羊，等.乙型肝炎病毒全X基因的喀克隆及原核表达J.第四军医高校学孰报,XX,252133-2135.