GB_T 43636-2024 法庭科学 DNA二代测序检验规范.docx

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1、ICS07.140CCSA92三中华人民共和国国家标准GB/T436362024法庭科学DNA二代测序检验规范ForensicsciencesSpecificationsfornextgenerationsequencing-basedDNAexamination2024-03-15发布2024-10-01实也国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会目次1 范视I2规范性引用文件I3术语和定义、细略语I4总体要求35原理36寄材和试剂47检验旅程48数据分析59遗传参数计算8附录A（资料性）法庭科学DNA：代测摩梭也记北叔9参考文峨17本文件按照GB1.1-2020C标准化工作导则第1部分：标

2、准化文件的结构和起草6糕的规定起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的货任.本文件由中华人民共和国公安部提出.本文件由全国刑事技术标准化技术委员会(SACZrC179)归口.本文件起草单位：公安部鉴定中心、四川大学、中国医学科学院阜外医院、广东省公安厅、中央军委政法委员会侦杳技术中心、中国政法大学、北京生物医药研究所，本文件主要起草人：叶健、李安全、王乐、康克莱、侯一平、周洲、张驰、李春燕、刘?修、张r峰、汤捌、袁明、岐文中、赵杰.法庭科学DNA二代涌序检验规范1范Bl木文件煨定了利用二代测序技术进行法庭科学人类DNA遗传标记把向洌序检的的以体要求以及检验器材

3、和试剂、检聆流程、数据分析、遗传参数计算的基本要求.本文件适用于从事法庭科学人类遗传标记检验的实验室和产品IM造商针对人类生物检材与样本的STRSNP1InDeI等遗传标记以及线粒体DNA进行二代测序枪将分析.2艘范性引用文件下列文件中的内容诩过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中.注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其赋新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GH/T27025检测和校准实验室能力的通用要求GB/T43633法耻科学DNA实验空建设规范GlVT43635法庭科学DNA实货室检验规范3*i三*4m*3.1 *X下列术谱和定义适用于本

4、文件。11.1DNADNAsequencing对DNA分子的核件酸桂列顺序的测定,即测定祖成核酸分子的腺空分（八）、鸟嗯畛(G)、胞吨呢(C)和阳腺唏咤(T)的排列顺序.X1.2二代IH序nextgenerationscquencing;NGS区别于传统Sanger(W脱1.链终止法)测序，能够次并行对大量核酸分子进行序列测定的技术，11.3IBWFtargetedSequeneing针对特定基因案或她因找区域内已知和新曲变异进行的测序.11.4密式PeRbridgepolymeraseChainreaction单燧文库DNAi端序列与芯片表向固定的磔核甘酸特异性结合.当连接片段的另一端泻曲,

5、与芯片灰面固定的另条互补赛核讣酸形成桥”.以文沐DNA为模板进行扩增的反应.X1.6乳化PCRemulsionpolymerasechainreaction将用于ECR扩增的水相体系与油相体系混合，形成大盘油包水的微汽液独立PCR扩地空间,在其中扩增得到大盘相同来源扩增产物的反应.11.6DNAMjmtDNAniinobll;DNB在二代测序的模板扩增过程中,先将DNA进行片段化处理,加接头序列和环化形成单蟋坏状DNA.然精通过浪环扩增将单链环状DNA扩埔23个数后汲收终产生的产物.11.7单次潴序singlerunsequencing测序仪落运行一个测序流程.如一次的向测序或一次双向测序的行

6、为.来源：GB/T309892014.3.20*1.8文JtUbrary通过生物来源的、人I.合成的或克隆技术等所得到的一个型建分子群.注r例如;墟H文库.互补DNA文库.噬语体履示肽文军等。来源：GBT30三-2014,3.5,有修改&1.9接头adapter用于标记和固定特测序片段的小段已知序列的DNA片段.3. 1.10筌index条码barcode一段特征性的脱氧核件酸短片段,在多样本混合榜测时，充当识别特定样本来源的唯一标志.X1.ll测序通量sequencingthroughput单次测序可获得序列信息的底因片段数状或可测定的脱气核糖核酸和核糖核酸（以喊期表示）数fit.来源：GB

7、/T309892014,3.21a1.12测序读长readlengthofsequencing测序能测得的最长IWA片段的长度。注：通常以喇考数表示.来源：GB/T3O9892014.3.21,育修改3.1.13，序SUEdepthofsequencing待测样本中某个指定的核仃酸或某条指定的序列被检测的次数，1来源：GB/T309892014,3.31,有修软a1.14MUIiRJMiEM*accuracyofbasecalling班次测序正确理基数占可识别做琏总数的比例.来源：GB/T30989-2014,3.27,有修改I1.lSMXiRSMrai*inaccuracyofbasecal

8、ling单次测序错误碱基数占可识别碱基总数的比例,j轼基识别正倚率（3.H）相对.来陶GB/T30989-2014,3.28.ftf31.lMqkrsimi(VBIityOfbCaniDg衡麻碱基正确识别的概率.通常以数字值直接表示,麟基识别质精:与碱基识别错误率之间的关系可用式(1)我示：Q=-IO-IgP(I)式中：Q一世堪识别质价：P一减基识别错误率.来源：GR/T30989-203.29,有修改J&1.1T分析诩值nalyticalthreshold能将检测到的估号与基线噪声进行可靠区分的最低测序深度(占比).12甯下列缩珞语适用于本文件.DN:脱氧核助核酸(DeOXyribOnUCl

9、eiCAcid)DNB:DNA纳米球(DNANanoball)InDeI:插入或玦失(InsenionDeletion)NGS:代测序(NeXtGenenilionSequencing)PCR:聚合酹锥式反应(PoIymEiseChainReaction)SNP:单核昔酸多态性(SingleNuclectidePolymorphism)SIR:短串联重更序列(ShortIandcmRepeat)4总体要求1.1 实脸室建设应符合GB/T43633(法庭科学DNA实脸室建设规范)的要求。1.2 实聆人员应熟:悉并掌握基丁二代刈序进行法庭科学遗传标记检船的原理和方法，并能正确使用分析软件对测序结果

10、进行分析与评价.1.3 实验室应有完备的文书体系.准确、清晰、完整地记录实验流程和结果.相关格式参见附录A.原始记录、报告等应归档留存，保证其具有可追溯性，1.4 实脸室的环境与设施应符合GB/T27025的要求，实脸室应设置文库构建区、核酸定量区.为了有效防止DNA污染，实验空应设置分隔独立的工作区域进行PCR扩增前帙作(试剂配制、样本洌;等)和后续PCR扩增、测序分析等检验操作,并标识区分不同工作区.检物流程应单向流动.必要时实现人员的单向流动，所有实龄操作应在规定区域进行.5 *3将生物检材或样本制备成待测样品，通过桥式PCR、乳化PCR或DNA纳米球扩增等PCR扩增技术,将待测样品限放

11、大，并收集成文席，然后进行平行循环测序，利用边合成边测序的策略,加入一种或多种带标记或不带标记的底物核甘酸，在聚合陶的作用卜,按照俄君”.补配对原则，进行DNA琏的延仲，延伸一轮测取一轮底物与模板结合后发出的信号，包括荧光信号、电信号或半导体芯片检测的离子信号等,收集该信号并确定所测位点的碱基信息.当上一轮测序完成后,揖史测序过程,即实现大规模并行茶因测序.6 111mo&i三M6.1.1 对于采用的检验潺材和试剂等产品应按照GB/T27025的要求经方法确认后方可使用。6.1.2 时采用的商业化或白行开发的法庭科学遗传标记：代测序检测试剂应进行质录评价验证，包括但不限于准确性、灵敏度、IS定

12、性、均衡性、理复性、检材适应性、种属特异性等.&2酬主要检验器材包括：a）二代测序仪：ftt基识别质量大于20.碱基识别防Iit过谑之后的测序准确率大于或等于99.1 用测序通量适合相应法庭科学遗传标记检验：b）PCR仪：c）荧光定JPCR仪:DNA提取试剂：用于择放、分离获得各类生物样本中的所有DNA并进行纯化：b）PCK笑合扩增试剂：用于大规模平行笑合扩增针对STR、SNP.InDeI等遗传标记或戏粒体DNA的各目标位点靶序列，试剂盒内至少应包含，拉增引物、犷增油及缓冲液：c）文陈构建试剂：用于核酸样丛的测序文诲构建,试剂盒内至少应包含：接头、DNA连接的或DNA蜃合命、缓冲液：d）测序试

13、剂：用于对测序文库进行二代测序,试剂盒内至少应包含：测序引物.测序反应艇及援冲液。7 Mtxa7.1 三N拉脸流程应符合相应试剂说明仿和仪器操作规范要求，并进行实脸室内部方法验证，制定相应的作业指导回内容至少包括：a）检验步躲：至少包括DNA提取与定量、测序文库构建、测序文库纯化与定出、测序检脸等：b）质量控制：至少包括DNA咙量和浓度控制、文库片段长度和浓度控制、溯序原始数据质附控耐、测序结果质汆评价等.7.2 DNA提取与帏化按照GB/T43635（法庭科学DNA实蕤室检紧规范的方法开展实验，井时DNA提取的桢法和浓度进行质量控制.宜采用荧光定量方法对DNA浓度进行定量.应对符合文库构也的

14、质址要求指标进行方法验证。如果核酸样品顺审不符合要求，应Hi新提取或增加样品址再进行相应操作。7.3 目将适fit的DNA加至引物混合液和PCRHi混体系中进行PCR犷增.旷增后选择合适的方式对PCR产物进行纯化。扩增反应体系及循环参数参照川应试剂说明书操作.实验应设置阳性对照和阴性对照.7.4 %m主要步骤包括添加接头、文阵纯化、文阵侦量控制和文库均化.材料和方法以文阵构建试剂说明书为准,其他注意事项包括：a）清晰标记添加的标签接头.防止标签之间造成污染：b）标签接头连接后采用破珠法或相关文库纯化试剂刈虻淄产物进行纯化处理IC）文库质心控制宜采用荧光定量:方法检测文库浓度，可选择采用生物分析

15、仪检测文库片段大小，实验空应采用方法验证确定符合测序要求的文库版依要求指标：d）符合历fit要求的文库进行均一化和混合.均一化浓度以测序试剂和测序仪器要求为准.7.5 WMMM*测序文库均一化、混合后,宜采用桥式PCR,乳化PCR或DNA纳米球扩增等方法进行信号放大处理,使信号强度涵足测序识别要求.材料和方法以测序模板制备试剂说明书为准.7.6 m测序即加入底物核甘酸,在测序酸的作用下使底物核甘酸与测序文库中的特测样品进行结合.同时收集该过程中产生的信号，包括但不限于荧光信号、电信号或禹子信弓,材料和方法您照相应二代测序试剂说明书.其他注意本项包括：a）根据采用的检测试剂和二代测序平台摸索确定合适的文理上机浓度：b）根据检浏的法耻科学遗传标记特性送拜合适的浏序读长以保证洌序结果准确和完整：c）根据不同测序平台