DNA甲基化与先天性心脏病的研究进展.docx

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1、脑的管状结构。神经看细胞在神经管接缝处形成，并快速迁移到身体各个部位，形成心脏组织、外周神经系统及身体其它部分。Schnetz不连续区域，对每一种细胞类型来说都具有特异性，CHD7的细胞特异性结合区与一组甲基化组蛋白H3赖氨:酸4(H3K4me)有关联.Vermeulen组蛋白H3赖氨酸4(H3K4me3)是一种在活跃基因上发觉的特殊甲基化标记，它为基础转录因子TFHD供应了一个结合位点，从而支持转录激活，组蛋白H3赖氨酸4发生甲基化可以变更基因转录，导致基因突变。2.3 1.INEl该基因是哺乳动物基因组广泛分布的散布性长核酸元件(longinterspersednucleotideacid

2、selement-1,1.I),B发觉U与多种生物学现象有关联，包括基因突变，X染色体失活,等位基因排斥，基因组重排，基因表达缄默，肿瘤发生，生物进化等。1.l基因全长57kb,反转座子长约6kb,5端为约91Obp的非翻译区(5UTR),其后为两个蛋白的编码区(ORFl和ORF2),两ORF之间为63bp的连接区，3端为约205bp的非翻译区(3UTR),末端是长度多变的多聚A尾。1.l甲基化状态的变更已在结肠癌、神经管缺陷和系统性红斑狼疮等疾病中广泛发生且被证明。WeiSheng风险。ShiniulChowdhury此，1.INE-I可能作为早期诊断，推断胎儿TOF发生可能性。2.4 JA

3、Gi基因该基因编码Notch家族受体配体蛋白jagged1蛋白，该基因在人类胚胎发育中起着重要作用，且主要在心血管系统表达，突变率较高，目前已发觉有200余种突变存在。该基因突变在大多数Alagille综合征(AGS)中被发觉，被证明是AGS致病基因，其中90%以上常合并心血管异样，大多数表现为肺动脉狭窄、法洛四联症等右心发育缺陷。族性法洛四联症。国内探讨发觉Notchl及其配体JAGl基因低甲基化在肿瘤发生发展中起重要作用，但该基因启动子发生甲基化与先心病是否相关仍有待于进一步探讨。6等探讨发觉TBX5突变可导致严峻的心脏畸形，以70国内采纳高效液相8等首次证明该基因是CHARGE综合征的易

4、感基因。9等探讨指出CHD7基因突变可引起心肌缺陷。CHD7定位于染色体的10等发觉甲基化11等证明1.INE-I低甲基化水平会增加发生TOF12等证明产妇1.INE-IDNA甲基化与CHDs相关,因13有报道JAGl基因突变引起家2.5NKX2-5该基因定位于染色体5a35,含2个外显子，编码324个氨基酸，是同源盒基因家族中的重要成员，它主要通过同源结构域(homodomain,HD)与目的基因中相应的顺式作用元件结合，作为转录因子启动下游基因的转录，在胚胎发育和器官形成过程中发挥重要作用。NKX2-5是心脏特异性转录因子，高度保守，是脊椎动物心脏育生中较早表达的转录因子，是心脏祖细胞最早

5、的标记物，贯穿心脏发育的整个过程。NKX2-5自胚胎发育第7.5天起先持续表达，其正常表达对心脏的环化、心房及心室发育、动脉干分隔、房室瓣形成及房室传导的维持均起重要作用。NKX2-5基因敲除小鼠表现为环化后的心脏发育停滞、血管发育异样，并在心脏完全环化前死亡。因此，可表明NKX2-5对于哺乳动物心脏的正常发育非常关键14临床探讨显示，NKX2-5基因在法洛四联症和房间隔缺损患者中有婚突变率。近年来，从表观遗传学角度探讨，该基因在先心病中的作用机制，成为热点。马端性圆锥干下畸形发病亲密相关。NKX2-5可能通过调整Jarid2(Jarid2Jmj)表达参加组蛋白去甲基化和甲基化的表观遗传调控2

6、.65,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(methyIenetrahydrofolatereductase,MTHFR)位于染色体lp36.3,编码区整个长度为1980bp,其cDNA序列长度为2200bpo该基因是与心脏发育亲密相关的一种特定细胞核转录因子，属于锌指蛋白转录因子，含有DNA结合域和转录激活域。DNA结合区由两个位于按基末端的锌指结构和邻近C末端减性氨基酸富集区组成。在中胚层和内胚层起源的组织中广泛表达，通过与其他转录因子如，血浆应答因子（SRF）、NKX2.5等相互作用，调控心肌中特异的基因表达。Garg19等探讨表明，该基因突变可导致先心病-室间隔缺损的发生。Zeisberg

7、GT4可调整心肌的增值，并且对右心室和房室管的发育具有特殊的阶段效应。GT4表达削减，将导致ASD、VSD.TOF等各种先心病。GATA-5是心脏原基胚胎中线的迁移和内胚层的形态所需的。GAT-5的过度表达引起包括心肌基因NKX2-5和产生病灶的搏动心肌组织异样的表达。在斑15等探讨表明KX2-5基因启动子甲基化可能与先天7。16。正常的MTHFR17018等实行MSP（甲基化特异性PCR）方法探讨VTHFR20等探讨发觉，心肌的马鱼模式动物探讨中表明GT-5限制斑马鱼生长、形态发生和心脏及内胚层的分化，并指出GATA-5调整心肌早期基因NKX2-5的表达基因小鼠试验中证明，GT-4和GT-5

8、表达削减可致心室壁变薄。GT-5其次等位基因的缺失可导致房间隔缺损，室间隔缺损，心内膜垫缺损等心脏畸形。因此，辛格等得出：GATA-4和GAT-5在心脏发育中起关键角色，但GATA-5在这个过程中准确机制，需进一步探讨。Akiyama,Y动子发生了甲基化。GT-5启动子甲基化和过度表达，在胰腺癌中有报道。同时GAT.M/5在胃低度上皮内痛变和不典型增生中探讨发觉成高频率的甲基化状态化水平与先心病相关性未见有报道，仍需进一步探讨。2.8 N0X5基因属于NADPH氧化酶家族一员，该家族有七个成员，目前从血管及内皮分别出的有NOX1、2、4、5,其中NOX5发觉时间短，探讨较少，已有探讨显示该基因

9、主要调整细胞增殖、细胞因子生成等。国内探讨NOX基因在缺血性心肌病患儿中表达上调。CHUNZHU平与先天性心脏病相关性，证明该基因在室间隔缺损患儿中CPG岛呈超甲基化水平（先心患儿甲基化水平为66.67%,而正常儿童中为20%）。2.9 P1.AG1.l基因抑癌基因P1.AG1.l定位于人染色体6p24-25,编码一种含有锌脂机构的核转录因子。P1.AG1.l具有广泛的抗细胞增殖、诱导细胞凋亡及抑制肿瘤生长的功能。国内外探讨均表明该基因表达下降与胃癌、乳腺癌、骨肉痛等发生亲密相关。ChaoXuan蛋白质编码的外显子2发生了同义突变，或许单纯VSD发病机制与这种突变无干脆关联，可能与P1.AG1

10、.l基因表达其他调控模式相关比如甲基化依匏模式。三、DNA甲基化检测方法新进展随着DNA甲基化与诸多疾病相关性的深化探讨，各种甲基化检测方法被相继开发。目前临床上进行大规模分析多重CpG岛的方法包括：限制性标记基因组扫描、特定的甲基化杂交、DNA微阵列法等，但在处理样本时尚存在一些实际问题，如由于在甲基化和午甲基化等位基因中杂交效率的不同而降低了探针的辨别实力，且这些检测方法有损于先进的芯片学和生物信息学技术，使其应用受到限制。以下是常用的甲基化检测方法。3.1 干脆测序法用重亚硫酸盐处理DNA,使未甲基化的胞喀咤转变为尿喑咤，而甲基化的胞畸咤不变，然后用不含任何CpG位点的引物进行PCR犷增

11、，以扩增时区分甲基化或非甲基化。扩增后尿喑喔全部转为胸腺啼唳，对PCR产物进行测序，且与未处理的序列比较，依据缺失条带推断CpG位点是否发生甲基化。该方法牢靠性和精确性均较高，且能明确目的片段中每一个位点的甲基化状态。缺点是须要大量的克隆测序，操作过程繁杂，费用较高。3.2 MSP（甲基化特异性的PCR法）先将DNA用重亚硫酸盐处理，随后进行引物特异性的PCRe该方法核心是设计引物，设计出的特异性引物与含有一个或多个CpG位点的待测序列结合，依据待测序列是否发生甲基化，则用相应的引物扩增出片段。该法的优点是：快速敏感性高，可用于超微量及同源分析，特异性接近100%,而且可用于石蜡包埋21。辛格

12、22等在转23等探讨表明GATA-4,5在结直肠癌（CRe）和胃癌中发生启24的超甲基化现象在人类肿瘤中普遍存在，GATA-425,GT45启动子甲基26等探讨该基因启动子甲基化水27等通过病例比照探讨，发觉在中国单纯VSD病人中P1.AGIJ样品的检测分析。缺点是引物设计要求高，牢靠的MSP用物设计需包含两个或多个完全甲基化或非甲基化的CpG位点,只能做定性探讨，不能作为定量检测存在。存在重亚硫酸处理不完全导致的假阳性问题。3.3结合重亚硫酸盐的限制性内切限法（COm切nedbisulfaterestrictionanyIysis,COBR）,该方法是先后对样本DNA进行重亚硫酸盐处理、PC

13、R扩增，处理后原甲基化的胞喀咤被保留，而非甲基化的胞啥咤转变为胸腺唯咤。然后利用限制性内切酶BstUI(CGCG)对PCR产物进行切割,来识别DNA甲基化的状况。该方法的优点：不须要预先知道CPG位点及样本序列；可进行甲基化水平定量探讨；所需样本量少，可用于石蜡包埋样本的分析。缺点：只能获得特殊酶切位点甲基化的状况，检测阴性不能解除样本存在DNA甲基化的可能，由于限制性内切酶和PCR的运用，序列分析受到限制。3.4甲基化敏感性斑点分析性ethylation-sensitivedotblotassay,MS-DBA),该方法是先用重亚硫酸盐处理标本DNA片段，而后以非CG区的引物进行PCR扩增，

14、将扩增产物转移到尼龙膜上,用3端DlG标记的含有2个CG或TG的双核甘酸探针与DNA杂交，然后用带有荧光标记的抗DIG抗体与之反应，通过比较斑点上荧光的强度进行甲基化水平的定量。该方法能够定量或半定量分析样本甲基化水平，简便易行,能检测多种样本。但检测序列不能过长，若重亚硫酸盐处理不完全或探针错误杂交，则可能出现假阳性或假阴性的结果3.5甲基化特异性多连接依靠性探针扩增(MethyIation-SPeCifiCmultiplexligation-dependentprobeamplification,VS-V1.PA)法，用MS-M1.PA探针与标本DNA进行杂交形成DNA-探针熨合物，然后加

15、入连接筋及甲基化敏感的限制性内切酶，假如DNA中被识别的CpG位点存在甲基化，则探针顺当连接，PCR照常进行；若为非甲基化,则两个宾核甘酸链不能连接，复合物将消化而不能扩增。其优点是所需的样本数量少,可分析大量的混合样本，可用于定量检测。缺点是探针连接位点受限制性内切膈识别位点的限制，还要考虑所用酶的相宜反应温度。综上所述，DNA甲基化在人类先心病发病机制完中起重要作用。探讨其发病机制，可以为从事该项目探讨的科研人员供应有价值的参考以及为先心病的早期临床诊治供应理论依据。随着DNA甲基化检测技术的提高，先心病的甲基化检测将得到有力的技术支持。但是由于样本量有限，以及无法精确获得心肌组织等诸多外因，无法明确外周血甲基化状况可否真实反映心肌组织甲基化水平。同时先心病的是多因素相互作用的困难疾病（包括环境因素，母体因素等），甲基化靶基因存在时空表达差异，故就增加了先心病诊断和治疗的困难性，故DNA甲基化在揭示先心病发病机制的价值需进一步探讨。参考文献：1HoffmanJI,KaplanS.TheincidenceofcongenitalheartdiseaseJ.JAmCol1Cardiol.2002,12:18901900.2GreulichF,RudatC,Kispert.Mechani