流行性出血热血清学、病原学诊断方法、病原学、临床及流行病学资料.docx

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1、附录A（规葩性）流行性出血热血清学诊断方法A.1I理摘获ElJSA法（MacE1.ISA）检测流行性出血热IRM抗体A.1.1原理根据抗原抗体特异性结合的原理.利用抗人U疑特异性抗体捕获待检测血清中的EM抗体.加入的标病毒蛋白抗原，也可加入病毒蛋Fl抗原或灭活病毒与相应的图标特弁性抗体,反应后加底物显色或发光。显色程度或发光强度与特异性IgM抗体含量型正相关。A.1.2标记抗原法A.1.2.1材料和试剂材料与试剂如卜，可根据所选用试剂盒的不同有所增诚。a）洗板机、解标仪、恒海骅箱或水浴希（372Cb）10U1.200U1.可调移液零、IOm1.吸管.c）植祥血清用的试管、吸水纸.d）然憎水或去

2、离子水，e）洗液（PBS-T：磷酸皓缓冲液,含0.05%吐温20,pH7.2,f）流行性出血热I弱抗体捕获E1.ISR渗断试剂盒。A.1.2.2检测步骤应参考所选用试剂盒说明书进行相关检测，检泅步骤如F.a）将阴、阳性对照血清.待检1批的Il梯择液按1:K）Cl稀择.加入已包被抗人U燧抗体的胸标板中.1001.fl4,置37C孵育1h.同时设空白对照.b）弃去上清，用PBS-T理洗5遍.C）将适当稀柞的科标记的病毒抗原加入反应板相应孔内，100H1./孔，37C羽有1h.创他与阴性对照孔仆OD值处于预测危围，PN2.1,对照成立：若待检血清孔Oim与阴性对照孔OD值比值32.1,则标本为流行性

3、出血热IgM抗体阳性,反之阴性，阴性对照孔（M）值小于0.05按0.05记,若大于0.05按实际数伯计算，但应小于0.2或0.25）。b）目测法：未加终止液前，在阳性时照血清为深裱色、阴性而黑血清为无色的情况卜，若样品孔颜色比临界较准血清孔深者为阳性,样品孔颜色比临界较准血清孔浅者为阴性.A.1.2.4意义I网抗体阳性,表示患者新近汉坦病毒感染，适用于流行性出血热早期诊断。A.1.3标记抗体法A.1.3.1试验材料材料与试剂如下，可根据所选用试剂盒的不同有所增减.a）洗板机、的标仪、恒温岬箱或水浴箱（37C2C）.b）10U1.200H1.可调移液器、10U吸管，c）称铎血清用的试管,吸水纸.

4、d）然饱水或去离子水，e）流.行性出血热IgY抗体捕获法EUSA诊断试剂盒.A.1.3.2检测步骤应参考所选用试剂盒说明书进行相关检测，检测步骤如下，a）将阴、阳性对照血清、待检血清用稀择液1:100倍稀择，分别加入反应板相应孔内，100M1./孔，置37C孵音1h。b）弃去血消,用洗繇液洗溜5次.c）将汉坦病毒抗原、对照病毒抗原按照试剂盒说明书，分别用柿棒液稀林至工作浓位，分别加入平行的两反应孔中，100M1./孔,37X?WW1h.d）弃去抗原，用洗涤液洗捺5次，c）将辣根过氧化物酹标记的抗汉坦病毒特异性抗体按照试剂盒说明书用稀样液稀择至工作浓度，加入诲个反应孔中.1001.,37rWlh

5、.f）弃去谶标抗体,用洗涤液洗涤5次.g）加显色液于每反应孔，100Ul孔，37C避光5min10min,至阳性对照孔显出蓝色，加终止液（4NHZSoJ于斑反应孔，50P1.Z孔.h）在30min内于45。nm波长处读取集孔的吸光度.A.1.3.3结果判断a）睥标仪读数法：阳性对照孔OMA与阴性时照孔（N）OD值处于预测范围，PNi21,对照成立:若待检血清孔OD值与阴性对照孔OD值比值32.1,则标本为流行性出血热Id抗体阳性,反之阴性。（阴性对照孔OD值小于0.05按0.05记,若大于0.05按实际数值计尊，但应小于0.2。b）目测法：未加终止液前.在阳性对照血清孔为深蓝色、阴性对照IfI

6、l清孔为无色的情况下,若样品孔与对照血清孔相比显示明显的蓝色则为阳性，若比时照血清孔浅或相似者则为阴性.A.1.3.4意义I龈抗体阳性，龙示患者新近汉坦病毒感染，适用于流行性出血热早期诊断，A.2I洲捕获法胶体金标记试纸条快速检测I洲抗体A.2.1试验材料材料与试剂如下.可根据所选用试剂盒的不同有所增减.a）肢体金标记试纸条快速IgM检测试剂盒：b）滴管或加样器.A.2.2检测步骤应参考所选用试剂盒说明书进行相关检测.检测步骤如下.a）如果试剂盒储存于4C冰箱,谓楮所有实验用试剂与器材取出，平衡至室温.b）打开密门的铝箱袋，取出试剂禽，平放于水平桌面上，做好标记。c）用滴管或加样器从盛有曲清或

7、血浆的试管中取2滴3滴或1001.-150U1.样品滴加于测试盒上的样品孔内,于1511nn内观察测试结果.A.2.3结果判断结果判新规则如下：a）阳性：可见质控线与实验线2条紫纣色带.b）阴性：只有一条政控线出现.c）无效：如果未能视察到质控税出现，则桧测无效，应近新检测-d）阳性结果可在加样后1min-2min即可显示出来，但阴性结果判断应在加样15min后方可判定。A.2.4意义IgM抗体阳性，表示费者新近汉坦病毒感染，可用干流行性出血热早期诊断,A.3间接酹联免疫吸附试缝检测抗汉坦病毒I时抗体A.3.1原理将重用I汉坦病毒蛋白抗原包被的标板，利用汉坦病甫蛋臼抗原鬲免疫原性结合样本中病毒

8、特异性抗体，可加的标记的抗人IgG抗体进行检测,反应后加底物显色或发光.显色程度或发光强度与特异性IgG抗体含Ift呈正相关。A.3.2试验材料材料与试剂如下，可根据所选用试剂盒的不同有所增诚，a）洗板机、脚标仪,忸湘箱或水浴箱（37C2C）b）10U1.200U1.可调移液器、101.吸管。c）确择血清用的试管、吸水纸.d）蒸馈水或去离子水.e）流行性出血热1或抗体的联免枝诊断试剂盒.A.3.3检测步您应参考所选用试剂盒说明书进行相关检测,桧测步骡如下.a）将侍检血清用稀棒液从I：100开始作2倍连续桶林至1:1600,加入抗原孔，100M孔，同时设阴、阳性对照，37U孵育1h.b）弃去血清

9、，用洗涤液洗涤6次，C）加质结合物.根据说明书用稀择液按工作浓度稀林,100ul孔,37C孵育1h.d）弃去的标抗体，用洗涤液洗涤6次.e）加显色液：于各反应孔内加A/B液各1滴.37C避光5min-10i11,至阳性对照孔出现蓝色.f）加终止液于每反应孔，501./孔。A.3.4结果判厮应站合所选用试剂iiS行结果判断，规则如下:a）限标仪读数法；在30Inin内于450nm波长处读取姆孔的吸光度，阳性对照孔OMIV阴性对照孔0网,即P/NH2.1,而照成立：若待检血清孔OD值与阴性对照孔OD比值2.1,则标本为流行性出血热IKG抗体阳性.反之阴性（阴性对照孔OD值小于0.05按0.05记,

10、若大于0.05按实际数值计算）.b）目测法：未加终止液前.在阳性对照血清为深蓝色、阴性对照血清为无色的情况下，若样品孔与对照血清孔相比显示明显的蓝色则为阳性，若比对照血清孔颜色浅或相似者则为阴性”A.3.5意义阳性结果，衣明曾受到汉坦病毒感染,1：100有诊断参考意义：恢狂期血清抗体滴度比急性期抗体消度布M倍或以上升高，或阳转，则可确诊.A.4免疫荧光试验（IFAT）榜测IEG抗体A4.1原理采用汉坦病毒感染细胞,如YerO或VeroE6细胞等，制备抗原片，结合血防或血浆样本中病毒特异性IgG抗体,然后使用荧光标记抗人IgC抗体进行检测,可在荧光显微镜下直接观察特异性荧光显色,阳性结果说明患者

11、四感染汉坦病毒，如果饯复期血清抗体滴度比急性期抗体滴度有1倍或I倍以上升高则可确诊。A.4.2试验材料材料与试剂如下，可根据所选用试剂盒的不同有所增M。a）抗原片：家狼型和她双型汉地病毒标准有株学染YCr。E6制备，低温干燥保存。b）阳、阴性对照:患者恢复期血清（阳性对照）、阴性血清.c）荧光素标记羊抗人（或免抗人IBG抗体，1）常用稀锋液；pH7.27.4,0.02ol1.PBS,伊文思蓝等.e）荧光显微慌.A.4.3枪测步骤应参考所选用试剂盒说明H进行相关检测，检测步骤略述如鼠a）用PBS检择待检血清,从1:20开始做4倍连续稀释至1:320,或至所偌要的稀择度.b）取出抗原片，用PBS漂

12、洗.c）用加样器.按照稀择度从高到低的帆1序依次加入待检血清.加入麻以用蔑细胞抗原面为准（若为双份血清，最好上排为急性期血清，下排为恢纪期血清），同时设阳性、阴性对照，在37C湿盒豺月30ini10min。d）用PBS洗涤3次,每次5min.e）用含伊文思蓝PBS按工作浓度稀择荧光结合物,滴加各孔（以覆盅细胭抗原面为准）.在37X?湿盒粒对30min,然后步骤同d）.f）荧光显澈镜观察结果。A.4.4结果判断细胞内病毒特弁性荧光为黄绿色购粒，分布在感染细胞的胞聚内.可根据特异性荧光颗粒多少、荧光亮度、阳性细胞在细胞总数中所占比例，将免疫荧光反应大致区分为1个，1个“+”，阳性细胞数:75%为“

13、+”：出现特异性荧光者为“+”阳性，无特异性荧光者为（阴性。检测抗体滴度时,以旎观察到明显特异性荧光反应（最高血消稀程度的倒数表示.A. 4.5意义阳性结果.表明曾受到汉坦病毒感染.大于1:20有诊断参考意义.愦红期血清抗体滴度比急性期抗体滴度彳1倍或4倍以上升面，或阳转则可确诊.附录B（规范性）流行性出血热病原学诊断方法可采用逆转录聚合前链式扩增（Reversetranscription-polyerasechainreaction,RT-PCR,实时荧光定It逆转录聚合曲链式反应（quantitativeReal-tieRT-PCR,qRT-PCR）、翳因测序或其他经过评估合格的病毒基因加

14、核酸检测方法进行检测，检出特异性病毒核酸具有确诊意义8.1流行性出血热痛雷RTfCR法核酸检测8. 1.1原理PCR技术是在特异性引物存在的条件下，利用双链DNR分子破玳配时原则，在体外扩增DNA片段，其特异性取决于界核甘酸引物的序列，引物与待扩增片段两条琏西段DNA序列分别互补结合后，在DNA聚合解催化下.引导引物的5端向3端方向延伸合成新融.是温度控制下可重复进行的热变性、更性延伸的温控循环过程,可使DNA产股呈指数上升.汉坦病毒为负性RM病毒,PCR扩增检测前需经过逆转录前作用，合成第一条CDM链,再进行PCR扩增,呻RT-PCR.设计不同特弁性引物可犷增不同种汉坦病毒基因。从患者标本中提取衲毒法因俎RN,利用适当方法进行核酸检测，可通过扩增片段大小赛定、基因如序列比对分析、特异性引物探针序列等方式，达到就原体鉴定和基因分鞭目的。B. 1.2试验材料材料与试剂如下，可根据所选用试剂盒的不同有所增M,a）急性期患者血标本或分岗的汉坦病毒：b） RNA提取试剂盒：c）汉坦病毒核酸扩增引物及分型引物（表B.1）：d）逆传录与PCR扩增试剂食.e）砂液器（10U20M1.100u1.200u1.10001.及配套吸头、PCR反应管、离心管（1.5m1.）及管架、台