Restriction endonuclease enzyme digestion限制内切酶.docx

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1、全酶切。EeoRIStRkytMStlckytMRecoMbMrtC*一前言：1950年科孥家樊现噬菌曲(phage)射大赐捍菌的不同菌株(strain)具召不同的感染实力。1962年瑞士科壁家WernerAitcr等人瞪出E.coliK菌株可羟生一值酵素能水解phage的DNA，因而耦悬限制薛素。1970年科家始利用限制醒素来鹿理白细胞分蹄出的畏脩型DNA以得到固定大小的特定DNA片段，可Bg用在基因组结横典重组DNA的探讨C二、目的：1 .揩分雕得到的飕DNA以不同的限制酬切割，遮asarose腭?g泳分雌DNA片段彼检定Ga或截切所需DNA片段，以暹行重能DNA(recombinantp

2、lasmidDNA)之建，2 .戴照DNA:PBaC-D-Pn539-E豹7.2Kb典PET-21(+)的5.4Kb分别以限制酣BamUl舆EcdRl切割来检定plasmid的正硅性。三、原理：利用限制性内切Bl切割DNA是DNA里殂谩程中的丽键步骤之一胜利的醐明飨工作供应了有效的灾验材料。限制性内切的是细菌飕内限制修系统内部。本r运切断的内切的,根榛用其中的11型酹射DNA分子暹行切割。在前切反惬中，DNA的钝度、缎衡液中的度、Mg2+、pH值、作用潮等因素均可影密反德一般可通遇增加酣的用量延是反愿畤冏等措施以逢到完限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)能!|寻骏

3、股DNA切的酵素。切割方法是符M分子典磷酸之fW的健结切斯，瘦而於南保DNA鲤上各度生TH切，且不被填核昔馥舆修基切割形式有所,分别是可命突出WKDNAJ末端.以及末端平联凸起的由於新的DNA片段可由另一硬偶悬DNA速接前的酢素黏合，因此染色醴或DNAERestrictionEnzymeActionofEcoRI不同的限制片段得以较由剪接f乍用而结合在一起。EcoRlSmaIGAATrC一GCTTAAGCTTAA跖次未StiCkyendCCCGGGCCCGGGCCCGGG曲末Mbluntend限制酵素分别在特定DNA序列切割DNA形成stickyend(cohesive)（八）DNAWR(g)

4、DNARCTTAAbCTTAATiIM1.EoRW制 已知的限制醐分悬TypeITypeII舆TypeIII三。 TypeI典TypeHI限制前同日等具有endonuclease典methylase的活性。 TypeI限制的曹庭檄的切割距雕辨i位置l0bp的序列，TypCnl刖只曾切割距蹄辨潢位置2426bp的序列。Tyg11限制前，即曾尊一地切割所辨戢的核酸序列的位置一般可辨戢燹股DNA上特定的4-8佃触基，能在IS知序列内的特定位JK上切割噎股摞旋DNA。每一槿限制的能辨特定的DNA序列址加以切割，但它不佛切割细菌自己的DNA四悬细菌DNA上的切割位宜已被甲基化T肖悬restriction

5、-modificationsystem不同的级!菌中可触化出具不同理一性的限制薛素可用来做基因剪接暗的I剪刀j使其成悬基因或分子道傅操作上趣悬有用的工具目前被Wf芝悉用於遇停工程、基(do11inQ和基1分析(genemapping)Cleavagesite(切制位工)typelll二林：restrictionmodificationMg*2orMna物辩婚位置均25-27bp的位J1.耨fttypeItypll如成之SUbUnit穆Si三段：一检：specificity:M堆位置restrictionrestriction:具内切够活性modification:具基峰活性我行CndOnUCl

6、easeMg*2,ATPMg*2作用暗所需之帕因子S-adenosylmethionine(SAM)雄制XS位置的100ObP只在将定加弊以外的任何位置位置内或旁造第一型限制睥同畤具有修ft(modificalkn)及12知切割(rc$lric【ion)的作用：另有熬知(recogn1ze)DNA上特定基序列的实力，通常其切割位(CIeaVageSiIe)距知位(攸OSniIionSile)可逢救干他崎基之道,址不能举硅定位切割位算i所以她不常用。例如：EcoB、EcoK。其次型限制廨只具有知切割的f乍用，修脚作用由其他薛素迤行。所熬知的位置多熟短的码文序列(Mindromesequence)

7、：所剪切的i法序列通常即舄所熬知的序列。是遭傅工程上C用性敕高的限制酶，例如：EcoRI、HindIII。第三型限制博典第一型限制醐似同畤具有修肺及熬知切割的作用。可熬知短的不封耦序列切割位舆知序列名勺矩24-26堪封她不能举硅定位切割位黠-所以她不常用。例如：EcoPIHin1111。上第II型限制酶第11型限制酹只曾辨熬特定短的DNA序列，因此IK泛被堰用於基因工程的技衙上目前商品化的,至品许多，可由生技公司脸得。此槿限制酣曾辨熬畏度4Ybps(或更是)等不同的核甘酸序列很举硅的在某一站上切DNA成轲稠的阚物交互分-追撞交互切口曾使DNA片段的5和3悠空成stickyend(orcohes

8、iveend突出湍) Palindrome：5.GAATT3,3CTTAAG5, Dyadsymmetry(two-foldsymmetry)限制酵素其HXOgnitiOnSite的核苦酸序列的度：四低!核甘酸的tetramer五他核甘酸的pentamer六值!核甘酸的hexamcr八他核甘酸的OCIomer-XrecognitionSitC愈长,此Site出现在【)、A上的概率愈小切割位愈少 Isoschizomcr(同裂酶)：不同限制薛素辨婚相同DNA序列切相同位置：perfectisoschizomcr一切不同位置：impcrfbctisoschizomcrTypeIlrestricti

9、onendonucleaseECORlCieaVgHindIlcleavage1：E：;二:.(protruding;overhang)Cohesiveend(Stickynd)3-KvlrovlHITAIM/一1j/一二一二二二Hx*二二-:r十7+l二二二-一/广；二-lmcesalbue5,GTCGC3,CAGCTG5GTCGAC-33CAGCTG-5SRhlStreptomvcexphaeoclm)tnoRttneS5,GCATGC3,CGTCG5-GCATGC-33CGTACG5biXanthemonaSbadHi5TCTAGA3,AGATCT5,-TCTAGA-3,3-AGATCT5*=平滑末喻Hume