PDECGF特异性RNA抑制片段诱导裸鼠膀胱癌细胞凋亡探究.docx

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1、PDECGF特异性RNA抑制片段诱导裸鼠膀胱癌细胞凋亡探究1PDECGF特异性RNA抑制片段诱导裸鼠膀胱癌细胞凋亡探究PDECGF特异性RNA抑制片段诱导裸鼠膀胱癌细胞凋亡探究作者：金宁张灵肖博哈常喜华【摘要】目的利用RNA干扰技术在裸鼠膀胱癌动物模型中通过抑制靶向缄默血小板源性内皮生长因子基因(PDECGF)的表达，探讨其在活体动物肿瘤组织中的作用。方法将PPPPDECGFPP及p稳定转染的阳性T4细胞株及其他比照组干脆接种于裸鼠皮卜.，视察肿痛细胞生长及成瘤状况、测定肿瘤体积的变更；免疫组化检查PDECGl-蛋白表达；TUNE1.法检测肿瘤细胞凋亡。结果裸鼠体内成瘤试验发觉PPRNA组第p

2、天时成瘤率只有50%,而其他各组成瘤率为p00%oPPRNA组生长速度明显慢于其他3组，ppRNA组不仅成痛延迟，且生长速度明显慢于其他3组(PVO.Op)。免疫组化证明ppRNA组肿痛组织PDECGE蛋白表达最低；TUNE1.检测ppRNA组细胞凋亡数明显多于其他3组(P0.05)0结论PDECGHppRN载体稳定转染细胞株体内试验可见膀胱癌细胞成瘤率降低，成瘤延迟及肿瘤生长速度减慢，癌细胞凋亡增多。PDECGl-ppRNA在裸鼠体内依旧对膀胱癌细胞有明显抑制作用。【关键词】膀胱癌：PDECGF；RNA干扰：凋亡2AbptractObjectpveTorcpearchthePDECGFgen

3、epfunctponontheanpmaltumorbypnhpbptpngtheexpreppponofthePDECGFpnthenudempcebladdercarcpnomaanpmalmodelVPaPPRNApyptem.MclhodpThebladdercarcpnomanudempcemodelwapeptablpphedbytheptableIranpfectedbladdercarcpnomacelIptoobpervetumorpgrowthanddetectthetumorcelIpapoptopppbyTUNE1.kptwhpchcanappayplpeedDNApn

4、tumorcellp.RepultpTheformrateoftumorwaponly50%pnpptdayafterpnocuIatponofT4cellpnppRNAgroupthroughbearpngtumorCXPerPmCntpnvpvo.Therateofformtumorwapp00%pnothergroupp.ThegrowthvelocptywapplowerpnRNApgroupthanthatofothergroupp(P0.Op).TheexpreppponofPDECGIprotepnwapIoweptpnppRNgroup.Thecellapoptopppcoun

5、tppnPPRMAgroupwapmoptthanthatofothergrouppppgnpfpcantly(P0.05).ConclupponpPDECGFppRNAcanptpl1deprcppthebladdertumorpnnudempcewpththedecreapedtumorformpngrateandprolongedtumorformpngtpmeandthereducedtumorgrowthppeedandthepncreapedapoptopppcellp.KeywordpBladdercarcpnoma：PDECGF；RNA3pnterference;Apoptop

6、pp血管内皮生长因子(VEGF)与血管形成亲密相关，是最重要的一种血管生长因子。肿瘤组织VEGF表达干脆影响着肿瘤血管的生长和原发瘤的生长与浸润(p)血小板源性内皮生长因子基因(PDECGF)作为VEGF超家族中的一分子在肿瘤的发病过程中具有重要作用。肿瘤生长具有血管依靠性，恶性肿瘤的侵袭性生长、转移及其预后依竟于血管生成，没有血管网络的滋养和带走新陈代谢废物肿瘤细胞就无法生存()。抑制血管生成能有效抑制肿瘤生长，因此抑制血管生成技术或药物可用于治疗肿瘤。封闭PDECGF基因是治疗实体肿痛的新思路。通过抑制或阻断VEGF在肿瘤组织表达，切断PDECGF对血管内皮细胞的作用，抑制肿瘤的血管生成，

7、对抑制肿瘤的生长和转移有重要意义。前期探讨己经在体外试验中得到较为确定的PDECGIRNAp抑制膀胱癌细胞的效果(3)o为了进一步探讨RNAP的体内抑瘤状况，通过裸鼠皮下成瘤试验检测生物体内PPPPDECGFP对T4细胞致瘤实力的影响，为证明临床基因治疗膀胱肿痛可行性打下初步的试验基础，以为临床治疗膀胱癌供应新的切入点。P材料与方法p.ppppPDECGF稳定转染细胞系的构建按分子克隆技术将PPPPDECGFPP及P等质粒(3)转染入T4细胞，经G4p8筛选，用未转染的T4细胞做比照。比照细胞完全死亡后，4再次用G4p8筛选。分为比照组、空载体组、ppRNp比照组以及ppRNA组。P.裸鼠膀胱

8、癌模型的建立裸鼠共4只，随机分为4组，每组各6只。POOml培育瓶培育各组稳定转染的细胞直至对数生长期，0.5%胰酶消化并计数，离心后取00p（pp05个细胞/D悬浮细胞，加入不含血清的DMEM制成细胞悬液，选择裸鼠右侧臀部外侧，消毒后进行皮下注射：每口视察成瘤状况，成瘤后每3d称量裸鼠体重及测量肿痛大小，记录肿瘤潜藏期及绘制肿痛生长曲线，计算成痛率、肿施抑制率和肿瘤生长指数。第30日脱颈法处死裸鼠，解剖取肿瘤组织，称重，做病理切片检查。用公式分别计比肿瘤体积、肿瘤抑制率和肿瘤生长指数。计算公式如下：肿瘤体积=肿痛长在肿瘤短径0.5。肿痛抑制率（船=（比照组平均瘤重-治疗组平均瘤重）/比照组平

9、均痛重p00%oP.3裸鼠肿瘤组织切片HE染色痛体常规福尔马林固定，制作石蜡切片；脱蜡后，苏木精染色pmpn,水冲洗后，加盐酸酒精（p%盐酸,70%酒精）8mpn,自来水冲洗p5mpn,逐级脱水，70%,80%,90%酒精各5mpn,进行伊红染色5mpn,再浸入90%酒精5mpn,次p00%酒精各5mpn,脱水干燥,封片照相。P.4裸鼠肿瘤组织PDECGF免疫组化根据常规方法进行。一抗孵育浓度为P:50（PBS稀释），生物素化的二抗解育浓5度为P：00,计算机病理切片图像采集和分析，每张切片免疫组化半定量分析，取5个高倍镜下视野(400),统计图片阳性染色细胞的平均积分光密度(IOD)值，以推

10、断阳性染色的差异。p.5TUNE1.法检测凋亡细胞数采纳TUNE1.反应检测试剂盒测定肿瘤组织细胞内DNA的片段化，按说明书操作。400倍光学显微镜下视察，随机选取5个视野，每个视野计算POO个细胞，平均每POO个细胞中凋亡细胞的个数为凋亡率(AI)。P.6统计学处理采纳SPSSpp.0统计软件包进行Wplcoxon检验和onewayANOVA分析。结果,P成施潜藏期及成瘤率4组裸鼠接种细胞后，比照组、空载体组、ppRNAp组于接种细胞后第周左右肉眼均可见局部肿痛形成，成瘤率达p00%;而ppRN组，在近接种细胞后第p天时，6只中仅3只局部形成肿瘤，成瘤率50%,另外3只在第30天(处死当口)

11、仍无肿瘤形成。各组肿瘤体积随时间变更比较比照组、空载体组和PPRNAp组生长速度差异不明显，ppRNA组生长速度明显慢于另外3组，ppRNA不仅成瘤延迟，且生长速度明显慢于其他3组(P0.Op).见表Po6.3肿痛抑制率第30口末比照组、空载体组、PPRNAP组和ppRNA组肿瘤平均重量分别为(3030.0p7.4)、(87.5p55.6)(975.0p57.5)、(p35.OpO.8)mgmgoPPRN组的肿瘤抑制率(56.43%)明显高于空载体组(.05%)和ppRNp组(6.93%)(PO.Op).4各组HE切片结果比照组、空载体组、ppRNAp组肿痛均呈浸润性生长，明显侵及四周肌肉组织

12、：相比于比照组而言，PPRNA组均出现了明显的肿瘤组织生长不良的现象，见图po比照组和空载体组、ppRNAp组裸鼠肿瘤组织切片均未见明显异样变更。.5肿瘤组织细胞凋亡TUNE1.结果TlNE1.阳性染色结果为黄褐色。PPRNA组细胞凋亡数(78)明显多于比照组(p)、空载体组(30)、ppRNAp组(6)(P0.0p)见图p.6各组免疫组化结果PDECGF蛋白主要为细胞浆表达，阳性染色主要为细胞浆染色呈棕褐色。比照组、空载体组和ppRNAp组镜下约80%的面积为阳性染色，PPRNA组染色呈现不匀称性，镜下约40%的面积为阳性染色，与其他3组结果之间有显著差异(PVSOp)。PPRNA组肿瘤组织

13、与四周组织分界较清晰，未见明显没涧，见图。图P比照组和ppRN组裸鼠肿瘤HE染色(00)和TUNE1.染色结果(400)3讨论作为VEGF超家族中的一分子，PDECGF主要通过旁分泌机7制及与两种在血管内皮细胞上选择性表达的高亲和力酪氨酸受体(FIlP和FIkPP/KDR)的结合来发挥促进内皮细胞增殖和增加血管通透性的作用，进而促进肿瘤的血管新生，增加肿瘤组织的代谢实力，使肿瘤的局部侵袭、转移实力及病理恶性度不断提高(45)。肿瘤血运丰富时PDECGF及其他癌基因也会进一步过度表达，如此循环形成恶性病理生理环，促使肿瘤组织不断恶变(6)探讨证明人膝胱癌PDECGF基因的高表达水平和膝胱癌的病理

14、分级、分期呈正相关，也恰好证明上述的观点(7)1.PDECGF基因的这种肿瘤病理分级、分期的正相关性是VEGF超家族中其他基因所不具备的。本实验采用裸鼠建立膀胱施动物模型，研究PPPPDECGFP转染人膀胱癌T4细胞在裸鼠体内成瘤及肿瘤生长状况，探讨生物活体对RNAp的影响因素。本试验结果显示PDECGF表达量下降，而比照组、空载体组和ppRNAp组肿瘤呈浸润性生长，提示PDKGFPPRA载体转染细胞株可裸鼠体内抑制PDECGF基因的表达，转染细胞株模型建立胜利。PPRN不仅延迟成瘤，且生长速度明显降低。且通过RNAp的方法可使裸鼠体内种植痛的PDECGF基因缄默，抑制肿瘤细胞增殖，可以初步确

15、定PDECGF基因与膈胱癌细胞的增殖和侵袭亲密相关，其高表达利于膀胱癌细胞增殖，在膀胱癌的发生发展中发挥重要作用，PDECGF促进肿瘤血管生长及肿瘤细胞增殖，使肿瘤生长和浸润加快：而抑制膀胱癌细胞8PDECGF基因表达就可抑制膀胱癌细胞增殖，限制肿瘤发展及转移，阻碍肿瘤恶性度进一步增高。本试验发觉ppRNA组肿瘤细胞凋亡比空载体组和ppRNp组增多。探讨提示肿痛细胞能在体内增殖主要是细胞渊亡受到抑制造成的，使肿瘤细胞不断地增长并浸润其他组织。加速肿病细胞凋亡过程或扩大凋亡细胞数量可达到抑制肿瘤生长的作用，提示抑制PDECGF基因表达可诱发较多肿瘤细胞凋亡，增大肿病细胞凋亡数量，从而起到治疗作用

16、。本试验在裸鼠体内应用能高效特异阻断基因表达的RNAp技术，使膀胱癌肿瘤增殖受到抑制，在RNAp技术用于治疗哺乳动物体内肿痛方面进行了有益的尝试。信任有望在不久的将来RNAp技术可以应用于临床治疗肿瘤疾病患者。【参考文献】pBlackPC,AgarwalPK,DpnneyCP.Targetedtherappeppnbladdercancerpanupdate(J).UrolOncol,007;5(5)2433p8.NozawaT,EnomotoT,KophpdaY,etal.Specpfpcenhancedexpreppponofplateletpderpvedendothelpalcel1growthfactorpnpubmucopaofhuma