细胞实验讲义－2021.docx

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1、实验一光学显微镜的使用及显微绘图（3课时）实验目的在普通光学显微镜下识别细胞和细胞器的形态结构，掌握生物绘图的方法。实验原理细胞在形态上是多种多样的，有球形、椭圆形、扁平形、立方形、梭形、星形等。虽然细胞的形状各异，但是它们却有共同的基本结构特点，都由细胞膜（动物）、细胞壁（植物）、细胞质和细胞核组成。细胞中的各种细胞器，如线粒体、高尔基体、中心体、核仁、染色体等,一般经过一定固定染色处理后，大多数在光学显微镜下是可以看见的（图1）。细胞器的形态结构在普通光学显微镜下与电子显微镜下所看到的结构有很大的差别。实验仪器、材料和试剂1.仪器：复式显微镜、擦镜纸2.材料：洋葱根尖切片、柿胚乳细胞、小白

2、鼠肝切片、马蛔虫受精卵切片方法与步骤一、洋葱根尖切片细胞的观察先用低倍镜观察根尖的纵切面，注意分生区、伸长区、成熟区细胞的异同，然后再仔细观察细胞的形态结构，特别注意细胞的形状、大小，以及细胞壁、细胞核、核仁、细胞质、液泡的形态结构。观察细胞有丝分裂不同阶段染色体的变化特点。二、柿胚乳细胞示胞间连丝的观察先在低倍镜下找到柿胚乳细胞，然后转用高倍镜观察，可看到细胞间丝状的联系。三、小白鼠肝细胞切片糖原的观察先用低倍镜后用高倍镜观察，可见到许多肝小叶，每小叶有许多紧密排列成索状的多角形的肝细胞，细胞中央有大而圆的细胞核。这时，转用油镜观察，可见到细胞质内分布着许多被染成深色的糖原颗粒。四、马蛔虫受

3、精卵切片中心体的观察取马蛔虫受精卵切片，在显微镜下找到充满子宫腔的受精卵，每个马蛔虫受精卵外围有一层较厚的卵膜，膜内有宽大的围卵腔，各围卵腔内有处在不同分裂期的卵细胞。找到分裂中期的细胞，在细胞中央被染成蓝色条状或棒状的结构，这就是染色体。在染色体两侧可见各有一个较小的，亦被染成蓝色的小粒，称中心粒。在中心粒的周围可见呈放射状的星丝。【作业】1 .画出柿胚乳细胞胞间连丝图，并标示出细胞的各部分。2 .绘制马蛔虫卵细胞中心体图，并标示出细胞的各部分。实验二细胞膜的渗透性观察（3课时）一、实验目的1 .了解细胞膜对物质通透性的一般规律。2 .了解溶血现象及其发生机制。二、实验原理细胞膜是细胞与环境

4、进行物质交换的选择通透性屏障。它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。渗透作用是细胞膜的主要功能之一。将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。本实验选用红细

5、胞作为细胞膜透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。实验用品（一）材料鸡血细胞（二）器材普通显微镜、普通离心机、扭力天平、IOmI试管、IOml刻度离心管、试管架，2ml注射器（无需针头）或5ml移液管、洗耳球、滴管、载玻片、擦镜纸、记号笔等。（三）试剂Alsever溶液葡萄糖2.05g柠檬酸钠（Na9C6H5O7.2H2O）0.89g柠檬酸（C6H6O7.H2O）0.05g氯化钠0.42g蒸馀水100ml调PH至7.2,过滤灭菌或高压灭菌Iomin,置4冰箱保存。1. 0.128mol1.NaCl溶液。2. 0.17mol/1.NaCl溶液。3. 0.17mol1.NaN

6、O3溶液4. 0.17mol/1.NH4Cl溶液。5. 0.17mol/1.NH4AC溶液。6. 0.32mol/1.葡萄糖。7. 0.32mol/1.甘油。8. 0.32mol/1.甲醇。9. 0.32mol/1.乙醇。10.0.32mol/1.丙醇。11.0.32mol/1.戊醇。12.0.32mol/1.丙酮。13.0.32mol/1.尿素。实验步骤：1 .从集市买一只活鸡现杀取血5ml（防止污染），放入盛有20mlAlseveFs液瓶中，混匀后置冰箱保存备用（2周内使用）。2 .使用前，取用AISeVeFS液保存的新鲜鸡血5ml,加入8mlfl0.128mol/1.的NaCI溶液，小心

7、混匀，1000r/min离心5min,如此3次洗涤，最后配成30%的鸡红细胞（CRBC）悬液。3 .取11支试管，按附表中所示测试溶液，分别取样各3ml,作出标记后，各管均加入红细胞悬液2滴，混匀后静置于温室中，观察各支试管中发生溶血的时间及其变化。观察结果：1 .试管内液体分两层：上层浅黄色透明，下层红色不透明为不溶血（一），镜检红细胞完好呈双凹盘状。2 .如果试管内液体混浊，上层带红色者，称不完全溶血（+或+）,镜检有部分红细胞呈碎片。3 .如果试管内液体变红而透明者，称完全溶血（+）,镜检发现细胞全部呈碎片。实验建议1 .鸡血在离心时，试管均需在扭力天平上平衡。2 .目测红细胞体积或置于

8、带刻度的离心管中，加入生理盐水配成30%的红细胞悬液；3 .试管中有红细胞和测试溶液时，不应强力摇晃，以免造成人为的红细胞破裂。目测法判断标准：快速溶血：+；慢速溶血：+或+；不溶血：一作业：1 .以表格记录各种溶液的溶血现象观察结果2 .就细胞膜对不同物质的渗透性不同，对实验结果进行分析。实验三液泡系、线粒体的超活染色与观察（3课时）实验目的：观察动植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布；学习一些细胞器的超活染色技术。实验原理：活体染色是能使生活有机体的细胞或组织特异性着色但对活样品又没有毒害作用的一种活体染色方法，其目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理

9、、化学变化以致引起细胞的死亡。活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。根据所用染色剂的性质和染色方法不同，通常把活体染色分为体内活体染色与体外活体染色两类。体内活体染色是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是靠染料的“电化学”特性。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，

10、这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但并非任何染料均可用于活体染色,理论上应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料,且使用时需要配成稀淡的溶液。一般说来,最为适用的是碱性染料，这可能是因为它具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿BOanUSgreenB）和中性红（neutralred）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色分别具有专一性。詹纳斯绿B专一对线粒体进行染色,这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系可以使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基（即无色状态）。中性红为弱碱性染料，

11、对液泡系的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能与液泡中的某些蛋白质有关。实验仪器设备：显微镜13台，擦镜纸1包，恒温水浴锅2台，Iml移液管26支（或者200U1.移液枪1把，200U1.枪头1盒），刀片26片，锻子26把，牙签1包，载玻片和盖玻片各26片，吸水纸若干。实验试剂：1、Ringer溶液300ml：NaCl2.55g；KCl0.75g；CaC120.09g；蒸储水定容至30Oml2、0.03%中性红溶液100ml：0.03g中性红溶于100mlRinger溶液中，棕色瓶保存3、0.02%詹纳斯绿B溶液100ml：0.02g詹纳斯绿B溶于100

12、mIRinger溶液中，棕色瓶保存实验材料：洋葱鳞茎内表皮细胞，小麦种子或黄豆幼根根尖实验步骤：一、线粒体的超活染色与观察（一）洋葱鳞茎内表皮细胞线粒体的超活染色观察1、取清洁载玻片，滴2滴0.02%詹纳斯绿B溶液2、撕取一小片洋葱鳞茎内表皮，铺展于染液中3、染色10-15分钟，注意不可使染料干燥4、低倍镜检，油镜观察二、液泡系的超活染色与观察1、实验前，把小麦种子或黄豆培养在培养皿内潮湿的滤纸上，使其发芽到ICm以上2、取清洁载玻片，滴2滴0.03%中性红溶液3、用刀片将出生的幼根根尖切一纵切面，放入染液中4、3染色10-15分钟，注意不可使染料干燥5、吸去染液，滴1滴Ringer液，加上盖

13、片，轻轻敲击，使根尖压扁6、低倍镜检，油镜观察实验四叶绿体分离与叶绿素自发荧光的观察（3学时）叶绿体足植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的。由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。实验目的1 .通过植物细胞叶绿体的分离。了解细胞器分离的一般原理和方法。2 .观察叶绿体的自发荧光和次生荧光.井熟悉荧光显微镜的使用方法。实验原理将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以

14、及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol1.氯化钠或0.4moJ1.蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在100Ormin的条件下离心2min,以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，在3000rmin的条件下离心5mia,即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。分离过程最好在05C的条件下进行：如果在室温下，要迅速分离和观察。荧光显微术是利用荧

15、光显微镜对可发荧光的物质进行观察的一种技术。某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荣光.若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光（或直接荧光），如叶绿索的火红色荧光和水质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光（或间接荧光），如叶绿体吸附口丫咤橙后可发桔红色荧光。利用荧光显微镜对可发荧光物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片，益玻片和无荧光油。实验仪器设备一、器材1、主要设备：普通离心机、组织捣碎机，粗天平、荧光显微镜。2、小型器材，50Oml烧杯2个,25OmI量筒1个,滴管10支，1Oml刻度离心管20支,纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。实验材料新鲜菠菜。实验试剂0.35mol1.氯化钠溶0.01%口丫咤橙(acridineorange)。实验方法1、选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g于15OmK).35mol1.NaCI溶液