OTUD5 TRIM25通过去泛素化活性调控肿瘤增殖机制.docx

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1、泛素(Ub)修饰蛋白在许多细胞过程中起关键作用，其参与包括信号传递、转录调控、细胞周期、增值凋亡、DNA修复损伤、炎症免疫等几乎一切生命活动的调控，并且与肿瘤、心血管等诸多疾病的发病密切相关。卵巢肿瘤蛋白酶(OVariantUmor,OTU)是去泛素酶(DUB)中被广泛关注的重点，其中OTUD5是多种细胞过程的关键调节剂，包括DNA损伤修复、转录和先天免疫等。然而迄今为止，OTUD5在肿瘤发生中的功能仍然未知。揭示了去泛素化酶OTUD5通过去除TRIM25泛素化进而参与转录调控，促进肿瘤进程的新机制。小鼠异种移植模型和人类肿瘤细胞实验进一步证实了，OTUD5-TRIM25轴在调节肿瘤生长中起重

2、要作用，为肿瘤的治疗提供了新的潜在靶标。研究速读1、TR1M25介导了OTUD5缺失诱导的肿瘤增殖作用研究人员首先发现，敲除去泛素化酶OTUD5能够显著促进肿瘤细胞增殖。而另一方面，三重基序蛋白25(Tripartitemotif-containingprotein25,TRIM25)属于E3泛素连接酶家族，是可促进细胞增殖和迁移的一类蛋白。研究人员因此进一步探讨了TRIM25在敲除OTUD5诱导细胞增殖中的作用。结果表明，敲低TRIM25部分抑制了OTUD5敲除导致的细胞增殖，这表明OTUD5缺失导致的细胞增殖促进作用可能是由TR1M25介导。进一步突变体实验(OTUD5、OTUD5C224

3、SOTUD5/S177A)和体外去泛素化实验证明,OTUD5的去泛素化酶活性会使TRIM251ys63去泛素化以调节TRIM25功能，在这一过程中，磷酸化对于OTUD5活性至关重要。所以，当OTUD5缺失时，TRlM25的自体泛素化与细胞增殖的关系，就是接下来研究的重点方向。CT1.WTP-WTC224SS177A0TUD5图IOTUD5缺失下细胞以TRIM25依赖性方式加速生长，与TRIM25泛素化有关2、TRIM25自体泛素化介导转录调控，抑制PM1.表达那么，TRIM25是如何促进肿瘤发展的呢？转录组分析表明，TR1M25会使肿瘤抑制蛋白(Promyelocyticleukemiapro

4、tein,PM1.)的表达下调，从而促进肿瘤细胞增殖。研究人员接下来对Huh7和Hep3B细胞进行了ChlP-qPCR分析，结果表明TRIM25至少部分通过抑制IRF-8募集至PM1.启动子来抑制PM1.表达。研究人员接下来测试了TRIM25在PM1.启动子上的富集是否受到RING域翻译后修饰的调控。结果证明，当RING结构域缺失(ARING)时，TRIM25突变体(TRIM25R1NG)的泛素修饰较少，其向启动子的募集被大大抑制；而RING域结构完整的突变体(TRlM25/WT)的泛素修饰表达，显著抑制了TRlM25缺失细胞中的PM1.表达水平。综上，TRIM25的自体泛素化对其在细胞增殖中

5、的功能至关重要。图2TR1M25的转录活性受RING域的调节3、C)TUD5-TRIM25轴调节肝癌的发展研究人员测试了OTUD5-TRIM25轴是否会影响小鼠模型中的肿瘤生长。结果表明，来自OTUD5耗尽细胞和PM1.耗尽细胞的肿瘤球比对照肿瘤球生长更快且重量更大，而TRIM25敲低抑制了肿瘤球的形成。此外，OTUD5/TRIM25双敲除细胞形成的肿瘤球体比OTUD5耗尽细胞的小，这表明OTUD5-TRIM25轴在调节肿瘤生长中起重要作用。图30TUD5-TRIM25轴调控Hep3B细胞的肿瘤球形成4、OTUD5显示出一般肿瘤抑制特性最后，我们评估了OTUD5的表达及其在人类癌症中的临床意义

6、。实验结果表明，敲低OTUD5在肺肿瘤细胞系中具有促进细胞增殖和降低PM1.表达的作用，而OTUD5在人非小细胞肺癌(NSC1.C)中的转录水平较低，同时PM1.的表达也下调，均与上述结果具有一致性。此外，研究者通过TCGA数据库评估了OTUD5表达与临床病理状态、患者生存率之间的相关性，表明OTUD5表达升高的患者，其总生存期明显更长。综上，研究证明了OTUD5有强的肿瘤抑制特性，并且在不同的肿瘤中均具有功能性后果。图4OTUD5表达与癌症患者的临床特征相关本研究为去泛素化酶和泛素连接酶的协同作用提供了新的例证，揭示了0TUD5通过去泛素化TRIM25调节基因转录并抑制肿瘤发生的新机制，为肿

7、瘤的有效治疗提供了潜在药物靶标。X)图5OTUD5通过调节TRIM25的泛素化和转录活性来调节PM1.表达和肿瘤发生参考文献：1.Fangzhou1.i,etal.,2020.TUD5cooperateswithTRIM25intranscriptionalregulatiOnandtumorprogressionviadeubiquitinationactivity.NatureCommunications.附相关参考：OTUD5通过去泛素化活性与TRIM25在转录调控和肿瘤进展中协同作用恶性肿瘤的形成是一个及其复杂的过程，一般需要经过几十年的时间。正常个体的组织细胞通过演化并逐步发展成具有

8、恶性表型的肿瘤，这一过程称为“肿瘤进展:肿瘤进展是由于DNA序列序贯发生了随机突变累积和表观遗传学改变，从而影响了基因调控网络相关的细胞增殖、生存，以及与恶性表型相关的其他性状。肿瘤发展中的侵袭性主要依赖于肿瘤细胞本身及相关基质中复杂的生物化学和生物学改变。这一进展过程被称为“侵袭-转移级联反应”，它涉及很多基因，这些基因的蛋白质产物可作为控制细胞生理的很多复杂的调节环路的组成部分。然而，我们对于肿瘤侵袭和转移的机制目前的认识依然十分有限，这些在肿瘤进展晚期出现的侵袭转移是肿瘤发病机制研究中主要悬而未决的问题。通过高通量测序技术手段，我们可以对肿瘤进展过程中各类促癌基因和抑癌基因等序列突变及表

9、达变化等进行检测，从而逐步揭示其背后存在的复杂的分子调控网络信息。本期我们通过一篇肝癌中0TUD5调节TRIM25泛素化水平和转录调控活性控制肿瘤进展的研究入门肿瘤进展研究组学研究思路。样本来源：对照SiRNAVS靶向TRIM25的siRNA转染Hep3B细胞，Huh7和293T细胞，4至6周龄雄性裸鼠研究背景OTU亚家族去泛素化酶与关键细胞信号级联的调节有关，但大多数OTU功能仍有待研究。通过无偏的RNAi筛选，显示敲除OTUD5可显著加速细胞生长。进一步的研究表明，OTUD5的缺失导致TRlM25的转录活性增强,并通过改变TRIM25的泛素化水平抑制PM1.的表达。研究思路研究结果1、C）

10、TUD5的消耗显著促进细胞增殖敲低筛选了14个人类OTUDUB（去泛素酶），发现OTUD5耗尽最显著促进细胞增殖，进行验证实验，使用两种不同的肿瘤细胞系Huh7和Hep3B来研窕siRNA介导的OTUD5消耗是否促进细胞增殖，结果表明OTUD5耗尽的Huh7细胞和Hep3B细胞都表现出比对照更高的细胞增殖率。2、TRIM25介导OTUD5耗竭诱导的加速生长通过Hep3B细胞裂解物的免疫沉淀(IP)证实了内源性OTUD5和TRIM25之间的相互作用。OTUD5在多肽的中心区域有一个OTU结构域，在保守的C端有一个泛素相互作用基序(UIM),通过构建UlM缺失质粒转染Hep3B细胞，免疫共沉淀结果

11、验证UIM域对于OTUD5和TR1M25之间的相互作用很重要，但可能不是唯一的相互作用位点。TRIM25的敲低通常会导致肿瘤生长减弱，进行RNA干扰，HUh7和Hep3B细胞的TRIM25敲低部分消除了OTUD5耗竭诱导的细胞增殖增加，这表明0TUD5敲低的细胞增殖促进作用可能是由TRIM25介导的。3、OTUD5对于去泛素化TRIM25至关重要TRIM25已被证明通过其RING结构域体现的E3泛素连接酶活性发挥其功能。为了测试OTUD5是否拮抗TRlM25的泛素化，我们生成了几种产生野生型0TUD5蛋白、无催化活性的OTUD5突变蛋白(OTUD5/C224S)和缺乏位点特异性磷酸化的OTUD

12、5蛋白突变体(OTUD5/S177A)的构建体,体外实验表明OTUD5催化TRIM25的有效去泛素化，TR1M25去泛素化需要OTUD5DUB活性，磷酸化的OTUD5在去除TRIM25的泛素链方面比野生型OTUD5更有效。敲除过表达实验表明OTUD5耗竭显著增加TRIM25多泛素化，OTUD5的共过表达抑制了TRIM25泛素化。dMAOTVO4、TRIM25敲低促进PM1.表达TRIM25已被证明在促进乳腺癌转移的信号网络中充当转录抑制因子。RNA-seq结果显示PM1.肿瘤抑制基因是表现出最大变异性的差异表达基因之一。PM1.mRNA和蛋白质水平的增加证实了TRIM25敲低细胞中PM1.的表

13、达升高。进一步实验发现TRIM25的共过表达上调了PM1.的泛素化水平，说明TRIM25通过转录和转录后机制发挥作用。PM1.通过调节肿瘤抑制因子(如P53、pRb、CBP和eIF4E35、55)的转录功能发挥肿瘤抑制因子的作用，为了进一步确定PM1.在TRIM25敲低细胞中表达改变的影响，通过RT-PCR评估PM1.靶基因的表达。发现CDKIA、BBC3BAX和H1.A-A的相对表达水平在TRIM25耗尽的细胞中上调，而Bcl2的表达水平仅适度降低。此外,TRIM25敲低不能再上调PM1.耗尽细胞中BAX的抑制。通过人类肝细胞癌(HCC)TCGA数据集评估了TR1M25的表达发现HCC肿瘤组

14、织中的TRIM25水平显著高于正常肝组织中的水平，且TRIM25的高表达与HeC患者的不良生存结果相关，对OTUD5耗尽的细胞进行RNA测序分析，GO富集的生物过程以细胞周期和细胞分裂过程为主，表明OTUD5-TRIM25轴可能通过调节细胞周期来影响细胞增殖。5、TRIM25自身泛素化介导转录调控为了探索与TRIM25介导的PM1.表达调控相关的机制，对Huh7和Hep3B细胞进行ChIPqPCR分析，结果显示TR1M25主要结合PM1.基因的转录起始位点（TSS）区域，与TRIM25通过定位于靶基因的启动子区域而充当转录抑制因子的观点一致。IRF-8通过位于PM1.启动子内的ISRE对IFN

15、-Y诱导的PM1.表达至关重要，实验表明TRIM25至少部分地通过抑制IRF-8向PM1.启动子的募集来抑制PM1.表达的可能性。作者认为RING结构域对TRIM25的翻译后修饰至少部分参与了TRIM25的调节，因此作者构建了一个表达突变TRIM25的质粒，其中删除了RING结构域,其表现出较少的泛素修饰，实验测试在PM1.启动子上富集TR1M25是否需要RING结构域，结果表明TRlM25的RING结构域被删除时，TRIM25向PM1.启动子的募集在很大程度上受到抑制。进一步实验表明TRIM25的自身泛素化对其在细胞增殖中的功能至关重要。6、0TUD5调节TRIM25的转录活性用OTUD5耗

16、尽的细胞进行的RNA-seq分析表明PM1.表达在OTUD5敲低后下调，即OTUD5与TR1M25结合并作为TRlM25去泛素酶发挥作用。使用OTUD5耗尽的Huh7和Hep3B细胞以及针对TRIM25的抗体，通过ChIP-qPCR测定确定TRIM25募集到PM1.启动子的程度。结果显示0TUD5的消耗增加了TRIM25在PM1.启动子上的富集。RT-PCR和蛋白结果显示OTUD5消耗，PM1.表达下降，此外，OTUD5敲低未能影响PM1.在稳定的TRIM25耗尽细胞中的表达，表明OTUD5对PM1.表达的影响是TR1M25依赖性的。7、OTUD5-TRIM25轴调节肝癌发展小鼠异种移植肿瘤实验结果显示来自OTUD5耗尽细胞和PM1.耗尽细