制备色谱技术原理及其在天然产物提取分离中的应用.docx

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1、摘要：制备色谱技术是用于分离提取天然产物有效成分的一种重要技术。现简要综述了各类制备色谱技术的原理，介绍了各类制备色谱技术在天然产物提取分离中的应用情况。关键词：制备色谱技术；应用；天然产物；原理O引言制备色谱技术发展至今己有100多年历史，其目的在于分离制备一种或者多种纯组分。从最早的常压柱色谱技术、薄层色谱技术，到后来发展起来的加压液相色谱技术、高速逆流色谱技术、模拟流动床色谱技术等，制备色谱技术己经成为现代科学研究和生产实践中分离多组分化合物的一个重要技术手段，尤其在自然界中天然产物活性成分的提取和纯化中起着重要作用。本文主要介绍几种重要的制备色谱技术的原理及其在天然产物分离纯化中的应用

2、情况。1 制备色谱技术的原理1.1 薄层色谱薄层色谱技术属于液相色谱技术的范畴，经典的制备型薄层色谱设备简单，投资较少，但处理量较小，通常用来分离毫克级的样品，且被分离的化合物需要从薄层板上刮下，并将其从吸附剂中提取出来。薄层色谱中常用的是硅胶吸附色谱，其次是氧化铝吸附薄层色谱。1.2 常压柱色谱常压柱色谱应用较为广泛，技术也相对成熟，主要包括吸附柱色谱、分配柱色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱、干柱色谱等。其中，吸附柱色谱中的硅胶吸附柱色谱是目前应用最为广泛的一种常压柱色谱。吸附柱色谱的技术原理是不同化合物由于分子结构不同，与吸附剂表面作用力的大小也不同，同一种冲洗溶剂对不同分子结构的化

3、合物溶解度不同，致使冲洗溶剂在冲洗时，不同化合物组分在色谱柱中的流动速度不同，从而将复杂混合物分离。1.3 加压制备色谱加压制备色谱技术是一种使用较为广泛的色谱分离纯化技术，它是将分离填料填装在色谱柱内，用液体流动相进行洗脱，利用药物中不同活性成分与填料相互作用力的差异来分离混合物。一般将压力0.2MPa左右的称为快速色谱；压力低于0.5MPa的称为低压制备色谱；压力在0.5-2MPa的称为中压制备色谱；压力大于2MPa的称为高压制备色谱，也叫高效液相色谱。制备型加压液相色谱分离的关键部位是色谱柱，色谱柱的大小取决于待分离样品量的多少。快速色谱技术操作非常简便，常用于简单的物质分离。它与柱色谱

4、类似，但比柱色谱多了一个加压装置，可缩短分离操作时间，填料颗粒较大，因此分辨率较低。快速色谱中使用最广泛的固定相是硅胶。低压液相色谱（1.P1.C）比快速色谱稍微复杂点，填料颗粒较小一些，分辨率也稍高。低压制备色谱的加压手段一般有空气泵加压、双链球加压、氮气钢瓶加压、蠕动泵加压等。中压制备色谱（MP1.C）可承载更大的样品量，色谱柱也较长较大，需要的压力比低压液相色谱更大，同时它的分辨率也更高，分离时间更短。其工作原理是由恒流泵输送移动相，通过进样阀上样，在色谱柱对样品进行分离后，利用检测器检测，计算机记录、处理、打印数据，同时收集各个微分。高压液相色谱（HP1.e）一般色谱柱较短，内径较大，

5、填料颗粒更细，具有高柱效、高流速、高分离速度的特点，可制备纯化难分离的物质，通常作为分离纯化操作的最后一步。高效液相色谱的压力较大，普通玻璃柱易破裂，一般选用不锈钢材料做色谱柱。1.4 高速逆流色谱高速逆流色谱（HSCCC）是逆流色谱中最具实用意义的一类，高速逆流色谱分离柱的固定相无载体，消除了载体对分离过程的影响，适合分离极性物质和具有生物活性的物质，且高速逆流色谱超载能力强，进样量大，尤其适用于制备性分离，同时具有高回收率。高速逆流色谱仪主要由恒流泵、进样阀、主机、检测器、色谱工作站和微分收集器组成。高速逆流色谱工作时，需要不互溶的两相液体，一种作为固定相，另一种作为流动相。它是根据单向性

6、流体动力平衡原理分离不同物质的,在主机的线圈一端注入固定相，进样后，恒流泵压入流动相载着样品进入线圈，线圈高速转动，两相就有相对运动之势，恒流泵的单向阀使得固定相无法逆向流出，流动相却不断流入穿过固定相，样品就会在两相中无限次分配，最终由于样品组分分配系数不同而被分离。高速逆流色谱仪转速越快，固定相保留越多，分离效果就越好。1.5 模拟移动床色谱模拟移动床色谱（SMB）技术首先应用于石油化学工业。通常的色谱分离技术存在间歇性生产、操作费用高等缺点，而模拟移动床色谱技术具有操作连续化、流动相耗量少等优点，因此该技术逐渐受到重视。与普通色谱技术相比，模拟移动床色谱技术具有操作自动化、制备效率高、制

7、备量大等优点，常用来分离手性物质，但其设备复杂，使用和维护困难，优化提纯的条件也较为复杂，所得到的产品液的浓度低于进料液的浓度，且模拟移动床色谱仪是一种二元分离器，应用范围较窄。模拟移动床色谱仪的固定相不随床层移动，而是通过物料进出口随流动相流动方向移动，实现固定相与流动相的逆流。根据液流流速和所起作用的不同，把整个床层分为4个区域，I区：吸附剂的再生区，II区：B的解吸和A的吸附，IH区：A的吸附和B的解吸，IV区：洗脱液的再生区。1.6 超临界流体色谱超临界流体色谱（SFC）是对气相色谱和高效液相色谱的补充，比高效液相色谱速度更快，溶剂更易除去，它以超临界流体为流动相，常用的超临界流体有C

8、O?,其临界点性质温和，成本低，安全，且纯度高。超临界流体具有气体黏度低、扩散系数大和液体溶解能力强的优点。超临界流体色谱技术的主要原理是根据待测物在固定相和流动相两相中的分配系数不同，继而实现对待测物的先后洗脱。2 制备色谱技术在天然产物提取分离中的应用2.1 在黄酮类成分提取中的应用2.1.1 1分离淡豆豉中的大豆异黄酮大豆异黄酮是黄酮类化合物，与雌激素结构相似，是由大豆成熟的种子和青蒿、桑叶等中药发酵而成的制品淡豆豉的主要活性成分之一。利用反相制备高效液相色谱技术（RP-HP1.C）,以乙懵-水-冰醋酸（35:65:1）为流动相，流速为3.0m1.min,进样量为7501.,从淡豆豉中分

9、离得到大豆异黄酮、大豆黄素和染料木素纯品，产物纯度均达到99%以上。2.1.2 分离高良姜黄酮中的高良姜素和山奈素高良姜提取物提取自姜科山姜属植物高良姜，其主要活性成分为黄酮类化合物，主要包括高良姜素和山奈素，具有抗肿瘤、抗病毒、镇痛消炎等作用。采用大孔吸附树脂和制备型高效液相色谱技术，从高良姜提取物中分离出高良姜素和山奈素，分离效果好，产品纯度高。制备型高效液相色谱的流动相为甲醇-0.6%乙酸水溶液（58:42）,流速为7m1.min,最终分离出的高良姜素纯度为99.55%,山奈素纯度为99.7%o2.1.3 分离竹叶黄酮中的异惹草昔和惹草昔知草昔和异萱草昔是竹叶黄酮中黄酮类化合物的两种主要

10、单体，具有抗氧化、抗炎等作用，其单体价格昂贵。建立了用制备型高效液相色谱技术分离竹叶黄酮中荀草昔和异知草昔的方法，色谱流动相为甲醇-0.3%乙酸水溶液（32:68）,流速为5m1./min,所得异宏草昔纯度可达99%以上，萱草昔纯度在93%以上。2.1.4 从甘草中提取黄酮类化合物甘草是蝶形花亚科甘草属植物甘草的根或根茎，具有清热解毒等功能，黄酮类化合物是植物甘草的重要有效成分之一。使用离线制备型二维正相液相色谱/反相液相色谱技术，从甘草中分离纯化黄酮类化合物，总共得到24种高纯度（纯度均在90%以上）黄酮类化合物。用模拟移动床色谱技术对甘草黄酮中的甘草昔和甘草素进行分离，以十八烷基硅烷键合硅

11、胶为固定相，乙醇-水（30:70）为流动相，在萃余液出口得到甘草甘，在萃取液出口得到甘草素，浓缩、重结晶后两种产品纯度均达到96%o2.1.5 从黄苗中分离黄酮昔黄芭是豆科黄芭属植物黄黄的根，黄芭中含有许多具有抗氧化作用的黄酮类化合物。利用高速逆流色谱技术对黄英中的黄酮昔进行分离纯化，得到毛蕊-7-O-B-D葡糖昔、芒柄花昔等5种高纯度黄酮昔。2.1.6 分离橘皮中的多甲基黄酮橘皮中的黄酮类化合物具有抗癌、抗氧化等生理作用。利用高速逆流色谱技术，以石油酸-乙酸乙酯-甲醇-水（1:0.8:1:1.2）为溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，从橘皮粗提物中分离出4种黄酮类化合物：5,6,7,8,3

12、f4,-六甲氧基黄酮、3,5,6,7,8,3,4-七甲氧基黄酮、5,6,7,8,4-五甲氧基黄酮、5-羟基-6,7,8,3,4-五甲氧基黄酮，其纯度分别为98.9%、97.8%、99.2%、99.8%02.2 在昔类成分提取中的应用2.2.1从玄参中分离哈帕昔和桃叶珊瑚昔哈帕昔和桃叶珊瑚昔是玄参中的主要活性成分环烯酸菇首类化合物的主要成分。从鲜玄参根提取物中制得哈帕昔和桃叶珊瑚昔的混合物,利用高效液相色谱技术，以甲醇-水（4:96）为流动相，得到哈帕甘和桃叶珊瑚昔的单体，两者纯度均大于99%。1.1.1 2.2从朱砂根中分离朱砂根皂昔朱砂根皂昔属于三菇皂昔，是朱砂根中的活性成分之一，具有抗癌活

13、性和抗HIV活性。采用C8色谱柱分离朱砂根皂甘，并用反相高效液相色谱技术，色谱流动相选择了甲醇-水，经过一次分离得到朱砂根皂昔单体，纯度为96.4%o1.1.3 从人参花蕾和三七叶昔中分离人参皂昔人参皂昔属于固醇类化合物。人参皂昔是人参花蕾中的主要活性成分，具有改善细胞代谢水平、增强机体功能的作用。人参花蕾中有两种主要的人参皂昔：原人参二醇型皂昔和原人参三醇型皂甘。采用正相低压制备色谱技术，以正丁醇-乙酸乙酯-水（4:1:5）为流动相，流速为8m1./min,将原人参二醇与原人参三醇分离，再采用制备型高效液相色谱技术纯化人参皂昔Re,纯度可高达98.5%。三七是五加科植物三七的干燥根，具有镇痛

14、、止血、抗心血管疾病等作用，人参皂昔Rb3是三七叶中的人参皂昔之一，具有镇静催眠的作用。用大孔吸附树脂精制三七叶昔提取物，再以正丁醇-乙酸乙酉旨-水（2:1:1）为流动相，流速为40m1.min,从三七叶甘精制物中分离出人参皂昔Rb3单体，纯度在95%以上。1.1.4 从甜菊糖中分离莱鲍迪昔A和甜叶菊昔甜菊糖提取自菊科草本植物甜叶菊，由甜菊昔、莱鲍迪昔A等许多不同的成分组成，是一种天然的甜味剂。采用中低压制备色谱技术，从甜菊糖结晶母液中分离出莱鲍迪甘A,以乙懵-水（80:20）为流动相，流速为4m1.min,最终得到莱鲍迪昔A单体的纯度为90.22%。以甜叶菊昔提取液为原料，利用模拟移动床色谱

15、技术分离甜叶菊昔,工艺参数为：切换时间12min,进样质量浓度40mgm1.,进料流速7.5m1.min,此条件下得到的产品甜叶菊昔纯度为80.69%,收率为93.48%。1.1.5 纯化何首乌活性成分二苯乙烯昔二苯乙烯昔是何首乌的主要成分之一，是一种多羟基酚类化合物，具有心血管活性、免疫调节等作用，同时具有降血脂、抗衰老作用。利用反相高压液相制备色谱技术对何首乌提取液的精制液进行分离，以甲醇-水（40:60）作为流动相，分离出的二苯乙烯昔含量达到97%以上。2.3 在酯类成分提取中的应用2.3.1 1从当归挥发油中分离纯化Z-藁本内酯Z-藁本内酯是当归、川茸和藁本等药材中的主要活性成分。采用

16、固相萃取预处理和高效液相色谱技术，以甲醇-水（70:30）为流动相，流速为8m1.min,从当归的挥发油中分离出Z-藁本内酯，经质谱、核磁共振光谱、红外光谱、紫外光谱共同检测，确定其最高纯度可达到99.6%o2.3.2 分离独活中的香豆素类成分蛇床子素是中药独活中的主要活性成分香豆素类含量最多的一种，有抗肿瘤的作用。利用高速逆流色谱技术从独活提取物中分离制备高纯度的蛇床子素，选用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1.5:2.5:2:1.5）为溶剂系统，上相为固定相，下相为流动相，流速为3m1.min,得到的蛇床子素纯度达到97.1%。利用高速逆流色谱技术，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1.5:2.5:2:1.5)为溶剂体系，从裂叶独活根中分离出二氢欧山芹醇乙酸酯、蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯，纯度均在96%以上。2.3