WS_T 360—2024 流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南.docx

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1、ICS11.020CCSC50WS中华人民共和国卫生行业标准WS/T3602024代替WS/T3602011流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南Guidelineforenumerationofperipheralbloodlymphocytesubsetsbyflowcytometry2024-04-02发布2024-09-01实施中华人民共和国国家卫生健康委员会发布,J.,A刖百本标准为推荐性标准。本标准代替WS/T3602011流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南，与WS/T3602011相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术内容变化如下： 增加了流式细胞仪性能验证内容（见5.1）；

2、完善了仪器质量控制和项目性能验证内容（见5.2、7.2.2）； 梳理和保留了检验前、检验中、检验后过程的内容及要求（见第6、1、8章）； 删减了标本采集和处理及临床意义内容（见2011年版的第4、10章）；增加了淋巴细胞亚群六色分析方案（见4.1.3、附录C）。本标准由国家卫生健康标准委员会临床检验标准专业委员会负责技术审查和技术咨询，由国家卫生健康委医疗管理服务指导中心负责协调性和格式审查，由国家卫生健康委员会医政司负责业务管理、法规司负责统筹管理。本标准起草单位：中国医学科学院肿瘤医院、北京医院/国家卫生健康委临床检验中心、北京大学第一医院、中国医学科学院北京协和医院、上海市交通大学医学院

3、附属第一人民医院、上海交通大学医学院附属新华医院、上海长征医院、苏州大学附属第一医院/江苏省血液研究所。本标准主要起草人：崔巍、彭明婷、屈晨雪、黄春梅、李莉、沈立松、周琳、朱明清、崔婵娟、李臣宾。本标准于2011年首次发布，本次为第一次修订。流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南1范围本标准规定了流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群：T淋巴细胞（包括CD4T细胞和CD8T细胞）、B淋巴细胞和NK细胞的技术要求。本标准适用于医疗机构临床实验室开展流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适

4、用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。WS/T806临床血液与体液检验基本技术标准。3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3. 1细胞分化抗原clusterofdifferentiation；CD不同谱系细胞在分化、发育、活化过程中，出现或消失的细胞表面标志。注1：细胞表面标志通常采用对应的单克隆抗体来识别。注2:已被命名的抗体有指定的CD编号，被特定抗体识别的特定抗原通常具有相同的编号。例如，被“抗CDI抗体”识别的抗原称为“CD1抗原”。1.2前向散射光forwardscatter；FSC光学检测器在入射光的正前方所收集的低角度散射光信号。注：FSe

5、与细胞或颗粒的大小和折射指数有关。1.3侧向散射光sidescatter；SSC光学检测器在入射光的直角处所收集的细胞散射的光信号。注：SSC与细胞或颗粒的内部及表面结构复杂程度有关，如细胞质颗粒性、膜不规则性及核型等。1.4设门gating在流式细胞图上基于一组参数来确定所要分析的目的细胞群，对该限定区域内的目的细胞群通过其他参数（如荧光参数）进一步分析其表达情况的过程。1.5荧光强度fluorescenceintensity结合到细胞或颗粒上的单克隆抗体荧光素多与少的量化指标。注1：在恰当的条件下，荧光强度与一个细胞或颗粒和特定荧光素相结合的位点数相关。即细胞或颗粒结合的荧光素越强意味着目

6、标标记分子的数量越多，反之越少。荧光强度越强则荧光信号的通道值也越大，反之越小。注2:荧光强度常通过相对荧光强度值的大小来表示，有算术平均荧光强度（meanfluorescenceintensity,MFI）、几何平均（GeometricMean）和中位荧光强度（Medianfluorescenceintensity,MdFI）3种计算方式。1.6染色指数stainingindex；SI量化评估阳性与阴性细胞群的分离程度的指标。注1：Sl通过阳性细胞群平均荧光强度（MFI）与阴性细胞群MFl的差，除以阴性细胞群荧光强度的2倍标准差计算而来SI=（MFImnw-MFImm）2rSDm三tt,用于

7、比较不同荧光染料在流式细胞术应用中荧光强度的差异。注2:Sl越大，荧光强度越高。进行抗体滴度测定时褥根据Sl来确定最适合的抗体用量。1.7荧光补偿fluorescencecompensation由于一种荧光素发射的荧光叠加到其他荧光素发射荧光的波长范围内而造成荧光信号重叠，通过在其他荧光信号中扣除已测定荧光信号的一部分从而纠正发射波长重叠造成的计数错误的过程。注：扣除的荧光量是用同型抗体来确定的，被校正的信号反映了单荧光信号的发射情况。1.8荧光微球fluorescentbeads一种表面结合特定荧光染料或内部包含一种或多种荧光染料用于流式细胞检测的人造微球颗粒。注：常用的荧光微球包括以下3种

8、：1）校准微球：与染色细胞大小和荧光强度相似的微球，用于检测每个荧光通道的线性、灵敏度和检测水平，也可用来检测抗体结合量或抗原密度。2）标准微球：大小一致、荧光强度与染色细胞相似的微球，用于检测通道的电压设置和荧光补偿设置。3）绝对计数微球：已知数量或浓度的荧光微球，与待测单细胞悬液在同一管中进行检测，以准确获得待测细胞的绝对计数。1.9相对细胞计数relativecelIcounts计算靶细胞群中目的细胞亚群数量的一种方法，计数结果以目的细胞亚群数量占靶细胞群细胞数量的百分比来表示。注：相对细胞计数单位：%3. 10绝对细胞计数absolutecelIcounts立算靶细胞群中目的细胞亚群数

9、量的一种方法，计数结果以每微升样品中目的细胞亚群的实际个数来表示。注：绝对细胞计数单位：个/应4. 11单平台方法single-platformmethod用于流式细胞术测定细胞绝对数量的一种方法，结果由流式细胞仪直接测定完成，无须使用第二种仪器测定。注：单平台方法可通过流式细胞仪结合绝对计数微球或精确进样体积等方法对目的细胞亚群进行绝对细胞计数。5. 12双平台方法dual-platformmethod用于测定细胞绝对数量的一种方法。结果来源于流式细胞仪和另一种仪器的检测。注：另一种仪器通常是血细胞分析仪。采用流式细胞仪获取靶细胞群中目的细胞亚群的比例（如淋巴细胞中CD4T细胞的比例），靶细

10、胞群通常是淋巴细胞群或白细胞群。采用血细胞分析仪测定同-样品中靶细胞群的绝对浓度（如淋巴细胞绝对值）。这两个检测结果相乘所得即为目的细胞群的绝对数量（如CD4T细胞绝对细胞计数）。4试剂和检测系统的选择4.1 荧光素标记的单克隆抗体宜选择荧光素直接标记的单克隆抗体，同时考虑所选抗体对细胞的反应性。单克隆抗体宜选择细胞分化抗原CD45、CD3、CD4、CD8、CDI9、CDI6、CD56。淋巴细胞亚群临床检测试剂应符合国家医疗器械注册要求。4.1.1 单克隆抗体的细胞抗原识别CD45为白细胞共同抗原，主要表达于白细胞；CD3为T淋巴细胞共同抗原，主要表达于成熟T淋巴细胞；CD4主要表达于辅助/诱

11、导T淋巴细胞(CD4T细胞)，也少量表达于单核/树突状细胞等；CD8表达于细胞毒T淋巴细胞(CD8T细胞)和少部分NK细胞等；CD19通常表达于B淋巴细胞和少量浆细胞；CD16表达于NK细胞、粒细胞、部分单核/树突状细胞等；CD56表达于NK细胞和细胞毒T细胞等。4.1.2 淋巴细胞亚群的鉴定抗体宜至少使用联合CD45的四色抗体组合方案。CD4、CD8、CD16和CD56单克隆抗体均不能专一标记淋巴细胞某一亚群，应采用联合CD45、CD3和多种抗体组合共同标记来鉴定淋巴细胞亚群。采用CD45作为设门抗体，兼做质控试剂。CD45联合SSC设门圈取淋巴细胞，尽可能排除其他细胞或颗粒干扰，门内淋巴细

12、胞的纯度应295%。如果样品中的淋巴细胞数量较少或者单核细胞对淋巴细胞分群有干扰，推荐同时加入CD14作为设门抗体，圈取CD14-细胞群。CD3T细胞标记为CD3,CD4T细胞标记为CD3tD4CD8,CD87细胞标记为CD3CD4CD8,B细胞标记为CD3CD19,NK细胞标记为CD3CD16&56或CD3CD56。4.1.3 组合抗体常用荧光染料联合CD45的四色方案常用荧光染料包括但不限于：异硫银酸荧光素(FITC),藻红蛋白(PE/RD1),藻红蛋白-花青素5(PE-Cy5)或多甲藻叶绿素蛋白(PerCP)、藻红蛋白-德州红偶联物(ECD)或别藻青蛋白(APC)等。目前常用各种荧光素的

13、激发波长和最大发射波长见下表1。选择联合CD45的四色方案进行淋巴细胞亚群检测时，宜使用但不限于配置有488nm、可兼具633nm/635nm/640nm激光器且有可接收四色荧光信号检测通道的流式细胞仪。联合CD45的六色方案常用荧光染料包括但不限于：异硫制酸荧光素(FITC),藻红蛋白(PE/RD1)、多甲藻叶绿素蛋白-花青素5.5(PerCPYy5.5)、藻红蛋白-花青素7(PE-Cy7).别藻青蛋白(APC)和别藻青蛋白-花青素7(APC-Cy7)等。选择联合CD45的六色方案进行淋巴细胞亚群检测时，宜使用但不限于配置有488nm和633nm/635nm/640nm激光器且有可接收六色荧

14、光信号检测通道的流式细胞仪。表1.常用荧光素的激发波长和最大发射波长荧光素激发波长最大发射波长异硫氨酸荧光素(FITC)488nm525run藻红蛋白(PE/RD1)488nm575nm藻红蛋白-花青素5(PE-Cy5)488nm670nm多甲藻叶绿素蛋白(PerCP)488nm675nm藻红蛋白-德州红偶联物(ECD)488nm613nm多甲藻叶绿素蛋白-花青素5.5(PerCP-Cy5.5)488nm695run藻红蛋白-花青素7(PE-Cy7)488nm785nm别藻青蛋白(APe)633n11635nm/640nm660nm别藻青蛋白-花青素7(APC-Cy7)633nm/635nm/

15、640nm785nm宜使用制造商推荐使用的配套溶血素，使用方法应遵循产品说明书的要求；如使用非配套溶血素或者自行配制的溶血素（氯化铉和低渗缓冲液等）时，应在使用前与配套溶血素进行同步检测并比对结果，以验证其性能。比对结果时以配套溶血素检测结果为参考，计算相对偏差或绝对偏差。检测结果符合实验室制定的评估要求，才可使用非配套溶血素或自配的溶血素。4.3 绝对计数微球用于单平台法淋巴细胞亚群的绝对细胞计数。将已知数量的微球与样品单细胞悬液放置在同一管中检测，根据获取的目的细胞的相对细胞计数和绝对计数微球的粒子数，得出目的细胞的绝对细胞计数。4.4 固定液如溶血索中含有固定成分，无需再单独使用固定液。否则，宜使用含有0l%2.0%新鲜配制的多聚甲醛缓冲液（pH7.07.4）作为固定液，固定免疫荧光标记并使用溶血素裂解红细胞后的样品，4C（28）避光保存，保存时间参考本标准第5.2.2.2.2条处理后标本稳定性的验证结果。5性能验证5.1 流式细胞仪的性能验证5.1.1 验证时机当新仪器启用前、搬移后、仪器发生重大维修（如更换激光、光纤、光电倍增管或流动室等）后、仪器软件系统更新后、仪