4T1、CT26.WT细胞培养.docx

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1、CT26.WT小鼠结肠癌细胞形态:成纤维细胞培育基和添加剂:RPMI-1640（GIBCo,货号31800022,添加NaHCO31.5g1.,glucose2.5g1.,SodiumPyruvate0.11g1.）,90%；优质胎牛血清，10%,1%的双抗（青霉素，链霉素）。气相：空气，95%；二氧化碳，5%o温度：37摄度。4T1小鼠乳腺癌细胞形态：上皮细胞培育基和添加剂：RPMl-1640（GIBCO,货号31800022,添加NaHCO31.5g1.,glucose2.5g1.,SodiumPyruvate（HlgZ1.）,90%；优质胎牛血清，10%,1%的双抗。（青霉素，链霉素）气

2、相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄度。细胞培育方法：（三）小牛血清的处理市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理，但在运用前还应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体（近来也有观点认为热灭活处理是不必要的）。胎牛血清不必灭活。1、将血清加热至56并保持30min,其间要时常轻轻晃动，使受热匀称，防止沉淀析出。2、处理后的血清贮存于4。3、小牛血清在运用前最好进行筛选以驾驭血清的质量。（四）生长培育基的配制除无血清培育之外，各种合成培育基在运用前需加入肯定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。培育基分装成小瓶（100200m1.）以便运用，翻帽塞塞紧瓶口。按如下比例配制：基本培育基占80%90

3、%,小牛血清或胎牛血清占10%-20%o按1%体积分数加入双抗贮存液（青霉素+链霉素），使青霉素和链霉素的终浓度分别为100Um1.和100m1.（五）冻存细胞的复苏应遵守慢冻快融的原则。先将水浴锅调至3737.5度，取出冻存的细胞快速放入后将细胞面浸至水面以下不断摇动至溶化。在无菌台内将完全培育基加入50ml的小培育瓶内，约5ml左右，然后用无菌吸管从冻存管内取出细胞，置培育并内轻轻摇摆，使细胞匀称后置培育箱内培育。（六）传代贴壁细胞：对于贴壁细胞应先吸（倒）尽培育基，吸得越干净越好，以免中和后加入的消化液，使强度减弱（或PBS洗1一3次）。50ml培育瓶加入消化液约l-3ml,按此比例进行

4、消化，（依据阅历），晃动使消化液铺匀称置37度培育箱约2-5分钟，镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后，轻轻振动瓶底使细胞全部脱落，加入2-3ml完全培育基后，轻轻吹打，使细胞基本成单个悬浮，然后分置其它无菌培育瓶内，加入完全培育基后接着培育或试验。悬浮细胞：i般传代可干脆将细胞原液分置其它培育瓶内，加入完全培育基接着培育，如要高浓度可先离心100OrPm,5min后加入完全培育基，轻轻吹匀后，分置其它培育瓶内加入完全培育基接着培育。（七）冻存将贴壁细胞消化后离心收集，悬浮细胞干脆离心收集，以完全培育基或胎牛血清重悬细胞至终浓度约106/ml。加入10%的DMS0。以每管12ml分装至冻存管中。用绝

5、热材料包袱置-70摄氏度冰箱冷冻过夜。次日保存到液氮中。（八）留意事项玻璃吸管和玻璃培育瓶的消毒:1）高压蒸汽灭菌15分钟以上;2）干烤消毒140度2小时以上；无菌工作台先清洗后用75%酒精擦拭干净，紫外线照耀40分钟以上;各种培育板照耀3小时以上；培育基（pH7.2）和血清配制好后要做无菌试验:将血清按10%加入培育基内，用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培育基5-10ml置培育箱内培育2-3天，肉眼见无浑浊或沉淀等异物。分装后置4度保存；消化液（pH7.8）或其它加入液，应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌，分装成支置-20度保存；培育箱应先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍（如有紫外线的应照耀1小时以上，如有高温灭菌的应按程序来菌）。至少每月一次。进入操作时应留意先清洗双手及手腕，然后用75%酒精擦拭，操作时留意无菌台内空间层次。手及物品不要在暴露的瓶口上方来往，假如数量较多，培育瓶应放在与酒精灯平行地便利于操作，瓶与瓶之间应相隔肯定的距离，开瓶（盖）时应先用75%酒精反复擦拭或用灯烧，打开后应用灯先烧口，然后烧盖。用完后同样操作。整个操作过程尽量在无菌台靠里面一点。