两性霉素B发酵染菌的原因分析及降低染菌率的措施.docx

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1、摘要：从两性霉素B的发酵工艺入手，介绍了两性霉素B的发酵工艺流程和设备流程，通过分析可能造成发酵染菌的原因，结合实际情况，确定了发酵染菌的主要原因，并制定了相应的控制措施，改进后的染菌情况大为改观。关键词：两性霉素B；发酵染菌；原因；染菌率；措施O引言虽然两性霉素B是含37个碳原子组成的大环内酯乳糖七烯类的抗生素，是治疗全身性深度真菌感染的唯一有效药物，但其副作用大、毒性大，而两性霉素B脂质体能有效弥补这一缺陷。作为两性霉素B脂质体的原料来源一一两性霉素B,采用生物合成法（微生物发酵法）生产，利用两性霉素B的产生菌，在一定的条件（包括培养基、温度、pH、通气、搅拌等）下使其生长繁殖，并在代谢过

2、程中产生两性霉素B,再用溶媒结晶法将两性霉素B从发酵液中提取出来，加以精制，最后获得两性霉素B成品。两性霉素B的生产工艺（菌种一电子制备一种子制备一发酵）属于发酵生产工艺。然而，发酵生产工艺要求，除大量繁殖两性霉素B的产生菌外，不允许其他杂菌（即染菌）的生长。染菌不仅消耗培养基中的营养成分，还会分泌某些对产生菌有毒性或者能使两性霉素B失去活性的物质。同时，降低两性霉素B的发酵单位，严重时会导致“倒罐”,即发酵过程中出现了较为严重的染菌现象，意味着发酵失败。因此，防止染菌，降低染菌率是发酵生产中一项长期、重要的工作。本文从多方面入手，分析可能造成两性霉素B发酵染菌的原因，并通过制定相应的措施，降

3、低染菌率。1 发酵生产简介1.1 1工艺流程两性霉素B的发酵工艺流程如图1所示。图1两性喜素8的发酵工艺流程1.2 设备流程两性霉素B的发酵设备流程如图2所示。图2两性耳索B的发Bl设备流程，1.3 关键工艺简述将节状链霉菌(Str.nodosus)培育至生产菌株，需经种子阶段、发酵阶段的通气培养，培养基由葡萄糖等原料作为碳源、酵母粉等原料作为氮源，并添加微量元素，整个培养繁殖过程应保持严格的纯种状态。在整个发酵过程中，需全程进行杂菌试验，以此来判断发酵过程是否染菌。通过观察菌种外观、镜检等手段来判断从一级发酵进入二级发酵（移种）的时机。两性霉素B经过发酵周期后，发酵液经酸化过滤，收集滤饼（两

4、性霉素B菌丝体）。2 染菌事件的调查在两性霉素B发酵生产中发生了染菌事件，通过调查发现，其均为二级发酵间歇染菌，调查结果如表1所示，染菌情况严重，造成发酵效价低，过滤困难，只能作“倒罐”处理。1两性0素8发酵生产中染的情况的调瓷批号。染国情况.MIWu/D平均效价/（u/qx过港速度，Mlosjt5Bin.备注1604OlJ5018444712。a160402-染IS和3697a8倒热，160403.6490%，13P160404*8515R16。P1605015038160502“染困。44魄、6“倒耀,，160503-6533S15-160504“Qv5121“的a160601“染国加35

5、91P倒山160602”染的加3182“倒力160603*-染DB如4242。倒置,，160604。染IBg362*3。小注：（1）您表示正常，无染菌；表示已染菌；（2）染菌率=染菌批次/总批次XIo0%。从表1可以看出：12批两性霉素B发酵的染菌率为50%,染菌情况严峻。3 染菌原因分析及要因确认两性霉素B发酵生产中的染菌原因分析及要因确认如表2所示。2同性B中立版，国分VuI裳flBU里因分析a*09气从统中东分过多!2气京晚中求分过多.再发4Ut!（大筑双依，下隆,空气，N空气”乞反燃的Jlit分H不当空气冷匕-改竹乂境外友不当,未Mri，心境筑又，核Q蜕“空气的七It介I1.a缓用鼻乙

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7、主因人,次压力气或不信定汽氐力气旗不构定通喂天,不过或主因火9不常位火Hjt-TSUt的叔京建.4Im作人大A。状式筋11公讥和翼仁天金付不充位树夕主因ZEHfl8M爱JKVX使用不畲造嚏灭二冉/加奇就模多！!,少.望HaMI串达钵等.经衿6：R我日于：方里。隹网比不熟途成W舞灭MK内段妾,趣愫多夕实年:不达胃au04材料JHlHuu,ft*919在两性霉素B发酵生产的染菌事故调查中，经过染菌原因分析及要因确认后，汇总并制成染菌原因鱼刺分析图，如图3所示。设备系统.空气净化系统4 采取的控制措施根据两性霉素B的染菌原因鱼刺分析图，针对引发染菌的主要原因,制定相应的控制措施，如表3所示。原因目标

8、“措施。空气系统中水分过多Q有效除湿定期检查、定时消毒，及时放出冷凝水斑体渗漏*杜绝跑冒滴漏捉漏、堵漏理内设计不合理。优化设计调整空气分布口位置；调整出料管道口距爆底的能离J，增加排汽出口“蒸汽供应压力低或不稳定”保质保量有效控制，保证足够压力的饱和蒸汽Q灭国操作不到位强化监管加强人员的质量教育、培训，严格执行SOP坚持先培训后上岗的原则工艺弱点,修正工艺，优化原材料比例，控制好消毒液面。4.1 空气系统中水分过多总空气过滤器的失效多数是由空气系统中水分过多造成，若不能有效除湿，过滤介质极易失效，引起污染。针对这一情况，应落实专人负责空气系统的管理，定期检查，定时消毒，及时放出冷凝水，并对空气

9、在进入总过滤器之前加热升温，使得相对湿度下降，然后进入总空气过滤器除菌，尽可能减少空气系统中的水分。4 .2罐体渗漏对发酵罐进行大范围检修，在罐体内电焊捉漏，检查夹套是否腐蚀穿孔，检查管道和连接部件安装是否合理；对罐壁、电焊缝渗漏处作相应处理，严密堵漏。5 .3罐内设计不合理(1)针对空气分布口偏高，影响发酵液吸收溶氧的情况，应降低空气分布板位置，使分布口高度适宜，使发酵液有效吸收溶氧。(2)针对罐内出料管道口距罐底距离过大，影响发酵罐清洗，从而造成发酵罐染菌的情况，应把原来高度在100nHn左右出料的管道口改为基本接近罐底。(3)针对排汽管道细，排汽不流畅，出现死角的情况，应清理旋风器，增加

10、排汽出口，减少排汽死角。6 .4蒸汽供应压力低或不稳定蒸汽供应的压力稳定是保证发酵系统有效灭菌的基础。若蒸汽压力不稳定，就会因为灭菌不彻底造成污染；若蒸汽压力低，就会造成灭菌时间长，进而破坏培养基。一般蒸汽由动力车间供应，因此，应保证足够压力的饱和蒸汽及其稳定性。7 .5灭菌操作不到位（1）为了提高相关操作人员的素质，应对操作人员进行SOP教育培训，并进行考核；（2）强化管理，严格要求员工按照岗位SoP操作，认真控制预热温度、罐温及维持罐内培养基温度，严格控制进料流量，保证灭菌质量；（3）抽查操作人员的工作情况，并与工资、奖金挂钩。8 .6工艺弱点针对消毒时液面高的现象，可提高某培养基使用比例

11、，降低另一培养基使用比例，使消毒液面得以有效控制。9 效果检查与对比在针对两性霉素B的染菌主因，制定并落实了相应的控制措施后，染菌情况大为改观，染菌率直线下降，具体效果如表4所示。图4为改进前后两性霉素B的平均效价对比，图5为改进前后两性霉素B的染菌率对比。*4改进后的染国效果数据批号”染前情况2三M”叽）“平均效价/（U/叽）“过滤速度，三10叽/5JdmJ备注。1610012O*)74236451“旧161OO2*56651*1短161003“442228倒161OOV8030212“161101”3757515161102“6348)1的婿161103a7152Ia3161104a649

12、91和/161201“O-663“161202*)5833161203，3546917“161204，5378侬注：（1）您表示正常，无染菌；表示已染菌；（2）染菌率=染菌批次/总批次XIo0%。从表4可以看出：12批两性霉素B发酵的染菌率为8.33%,染菌问题大有改观。图4改进前后两性餐素B的平均效价对比图5改进前后两性富素B的染国率对比，10 结语本文从两性霉素B的发酵工艺入手，介绍了两性霉素B的发酵工艺流程和设备流程，通过分析可能造成发酵染菌的原因，结合实际情况，确定了发酵染菌的主要原因，并制定了相应的控制措施，改进后的染菌情况大为改观。同时，建议采取以下巩固措施:(1)制定管理标准，加强对设备等的定期检查力度，每月进行检查、维修，发现问题及时解决；(2)修正工艺规程，并写入标准操作规程；(3)制定岗位培训计划，对员工定期进行各项规章制度、岗位操作规程及相关文件的培训，并严格遵照执行。