碳青霉烯类耐药性在人源和动物源产NDM酶大肠埃希菌间的传播.docx

《碳青霉烯类耐药性在人源和动物源产NDM酶大肠埃希菌间的传播.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《碳青霉烯类耐药性在人源和动物源产NDM酶大肠埃希菌间的传播.docx（14页珍藏版）》请在优知文库上搜索。

1、一、引言抗生素耐药性是21世纪全球最大的公共卫生挑战之一，碳青霉烯类药物是我们治疗危及生命的多重耐药菌感染的最有效抗生素之一。不幸的是，碳青霉烯耐药肠杆菌（CRE）的快速传播是目前困扰住院患者和医生的主要问题，因为CRE对碳青霉烯类药物、头抱菌素类药物和青霉素类药物均表现出高水平耐药性，严重限制了治疗方案。因此，CRE被称为“梦魇细菌，同时伴随着大量的经济负担，并被列为首要的公共健康威胁之一以及迫切需要优先研发新抗生素的病原体。目前，世界范围内医疗机构相关的CRE菌株主要产三种碳青霉烯酶：新德里金属-6内酰胺酶（NDM）、肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）和可水解碳青霉烯的氧青霉烯酶48型6-内

2、酰胺酶（OXA-48）产NDM菌株在50多个国家广泛流行，特别是在南亚（印度、巴基斯坦和孟加拉国）和中国，而产KPC菌株更普遍在北美洲和南美洲（美国、阿根廷和巴西）以及在中国和欧洲（希腊、意大利和以色列）流行。一项涉及36个欧洲国家的跨国研究显示,医院获得性碳青霉烯耐药大肠杆菌（CREC）中NDM和KPC阳性率分别为103%和7.2%。在中国，2014-2015年在25个省份收集的产NDM和KPC临床分离株分别占所有CREC的49.4%和39.6%。相反，在另一项中国19个省份健康人群的研究中，46.7%的CREC中blaNDM是唯一检测到的碳青霉烯酶基因。综上所述，这些数据表明，NDM是中国

3、大多数人源CREC菌株的碳青霉烯酶。在世界范围内来自食品、野生和伴侣动物的CREC菌株中，NDM仍然是流行最广的碳青霉烯酶。在中国，产NDM菌株正成为食品动物中最主要的产碳青霉烯酶菌株，并污染下游的肉制品，其中，boA一48和Hokpc极少出现。然而，尽管有一些证据表明CREC可在人与动物之间直接传播，但迄今为止，动物来源的CREC还没有被普遍认为是影响人类健康的问题之一。二、材料和方法（一）研究设计图1展示了本项研究的框架。文章由回顾性横断面研究开始。首先，从中国细菌耐药监测网（CHINET）中，获得在2016年1月1日至12月31日期间，中国30家医院的门诊患者和住院患者中收集的共计297

4、99株大肠杆菌分离株。这些医院多数为大型诊疗机构，共覆盖22个省（直辖市）,所在省（直辖市）总人口约9亿。为了避免重复，根据患者识别代码,临床标本中每个患者仅包含一个分离株。物种鉴定采用自动化系统,如Vitek2Compact（bioMerieux,法国）和PhoeniX-100（BectonzDickinsonandCompany,美国）系统或基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOfMS;BrukerDaltonics,德国）。使用Vitek2Compact自动系统（bioM4rieux）测定分离株对19种临床抗菌药物（头抱他噬、头抱嚷肠、头抱毗后、头胞哌酮/舒巴坦、哌拉西林/

5、他嚏巴坦、氨曲南、厄他培南、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、甲氧茉咤/磺胺甲嗖、磷霉素、黏菌素、吠喃妥因和替加环素）的敏感性。药敏结果根据CLSl（CliniCalandLabOratOryStandardSInstitute,美国临床和实验室标准协会）标准进行判读，至少对一种碳青霉烯类药物具有抗性的菌株被定义为CREC（图1）。Fnrtpert29799S CO*,29 IMCSEC 1QUkatx31CC*dorecatonNCBl E M 2 31SNM-trmn18M) 043) ( from CIWM) Hmn(rt15) OcMn(n123 S曲 y(

6、4S)1 sqnc type e)s (osnga 1 n 6mM warns 2. Sxxo trg rMrfyws 31:1)Xbcepctate from 22 p Dec 316 2016)Anthropogenicdato图1.数据来源及研究流程图CMIC：最小抑菌浓度；CSEC：碳青霉烯敏感大肠杆菌；POS：阳性：neg：阴性。其次，于2017年4月1日至5月31日间在辽宁、湖南和陕西三个省各收集22个猪养殖场和16个鸡养殖场的粪便样本，以评估Hgndm和Rag的总体丰度；关于样本采集和处理过程的细节己在之前的研究中描述，如果提取的DNA质量不足以进行下一步分析，则排除该养殖场数据

7、（图1）。如前所述，使用qPCR方法以16SrRNA基因为对照，评估RaNDM和Raw的相对丰度。再次,对全球的动物源和人源CREC菌株进行了全面的基因组研究，以确定它们在基因、质粒和菌株水平上的基因组特征和关联（图1）。详细的过程将在下文中描述.本研究于2015年11月24日获得复旦大学附属华山医院伦理委员会的道德许可（项目号：KY2015-285）o个人同意书采用普通话版本，并从所有住院患者那里通过面对面或电话交流获得同意。研究排除了不愿意参与本研究的个体，并且所有参与者都被告知他们有权在任何阶段退出本研究。（二）数据来源中国22个省（直辖市）的人口统计数据来自中国国家统计局和中国农业年鉴

8、。人为因素共分为6类，包括：国内生产总值（GDP）、人口（数量和密度）、抗菌药物使用、动物生产（食品动物和淡水养殖，主要是鱼和虾）、动物源性食品消费和每日动物源性食品摄入量。大部分数据收集于2015年，抗菌药物使用数据来自2013年。在基因组分析中，我们从NCBI数据库中下载了所有可用的中国NDM阳性大肠杆菌全基因组序列（=463）用于综合分析。我们还从NCBl数据库中获得了来自4个宿主（人、猪、鸡、蝇）的1852株NDM阴性大肠杆菌的基因组序列，相当于NDM阳性序列总数的4倍（图1）。所有菌株均给予有序自然数，并使用EXCel中的RAND函数随机选择进行相应分析。（三）基因组分析基因组序列分

9、析包括基因组组装、多位点序列分型、质粒检测和系统发育种群预测，具体描述见已发表的文章。使用Bandage（0.8.1版）对不含质粒免制子基因的序列片段进行分析，以确定可能的质粒类型。桑基图由R3.6.1中的networkD3软件包（0.4版本）生成。所有组装后的NDM阳性基因组序列用于核心基因组比对，通过RedDogpipeline生成系统发育树。该树使用TreeofLifev5进行可视化处理。（四）溯源分析我们使用DAPC(discriminantanalysisofprincipalcomponents)模型来预测所有NDM阳性大肠杆菌的潜在来源。所有菌株（n=2315）的核心基因组单核甘

10、酸多态性（SNP）图谱,包括NDM阴性的大肠杆菌，均使用snippypipeline生成。用于DAPC模型的1389株NDM阴性大肠杆菌的SNP矩阵通过R3.6.1中的Adegenet软件包实现。其余463株阴性菌株用于评估上述模型的拟合度。最后，利用构建的DAPC模型预测了所有中国NDM阳性菌株（n=463）的遗传来源。预测组:训练组：测试组=1:3:1。（五）统计分析将人口统计学和非临床数据输入EXCeI2016,将变量“年龄分为7个亚组（婴儿、学龄前儿童、学龄儿童、青少年、青年、成人和老年人），同时将变量感染部位分为5个亚组（血液、尿液、痰液、脑脊液和其他）。此外，基于之前对鸡生产和国家

11、猪生产计划的研究，我们根据年出栏量将中国大陆分别划分为2个鸡生产区和4个猪生产区。分类数据采用X2分析检验，连续数据采用Mann-WhitneyU检验。在SPSS23.0版本（IBM,美国）中进行单变量分析，随后使用Cramer系数（0）对P值0.05的变量进行共线性评估。如果一对变量高度相关（04.O）,我们选择更具生物逻辑合理性的变量进行多变量逻辑回归分析。单变量分析中具有显著性意义的变量将被用于多变量分析。采用向前逐步（似然比）方法对多变量逻辑回归分析中的混杂因素进行控制。最终模型中保留P值小于005的变量。逻辑回归模型的拟合优度采用Hosmer-Lemeshow检验。森林图使用R语言中

12、的forestplot包生成。使用R3.6l对bNDM的丰度进行分析和可视化。当丰度值低于检测限时，添加一个伪数值IXIO-7（低于最低丰度一个数量级）后再进行IoglO变换。不同组间的比较采用Mann-WhitneyU检验或Kruskal-WallisH检验，取0.05为显著性水平。三、结果（一）CREC与临床和非临床因素的相关性本研究设计示意图如图1所示。在来自中国22个省（直辖市）的不同感染样本中共分离到29799株大肠杆菌，其中，631株（2.1%）被鉴定为CREG四川省的CREC流行率最高（4.7%）,福建省无CREC分离株。对CREC感染患者的分析显示，男女比例为L4:1,但根据单

13、变量分析，男性CREC的感染率明显高于女性（P0Q5表明所选的模型适合当前的数据。图2.单变量（a）和多变量（b）分析的森林图。（一）敏感性试验药敏试验表明，CREC（n=631）对头抱菌素、头抱哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他嚏巴坦和氟噗诺酮类（58.8%95.7%）的耐药性明显高于碳青霉烯敏感大肠杆菌（Carbapenem-SusceptibleE.colitCSEC;n=29168,2.9%59%）（P0.0001）（表1）。CREC对阿米卡星和磷霉素的耐药率分别为16.8%和28.5%,而CSEC对阿米卡星和磷霉素的耐药率分别为2.7%和5.6%。CREC和CSEC对黏菌素和替加环素的敏感性均较高（大于96.7%）。值得注意的是，59%的CSEC对头抱口塞后表现出耐药性（表1）。虽然无法获得CHINET分离株的耐药基因型，但可利用NCBI数据库中中国临床大肠杆菌分离株（NDM阳性菌株和阴性菌株分别为195株和494株）的序列检测两组间的耐药基因阳性率。总的来说，除和OqXA8基因外,NDM阳性菌中大多数抗菌药物的耐药基因,特别是6-内酰胺耐药基因（Hacrx-MbGoA和b0cM)的阳性率显著高于阴性菌株。最近上传至NCBl的不携带NDM的mcr阳性菌株数量的增加可能是导致NDM阴性菌株中mcr基因阳性率更高的原因；