流式细胞仪.ppt.ppt

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1、 流式细胞仪的流式细胞仪的 FLOW CYTOMETERFLOW CYTOMETERFLOW CYTOMETERFLOW CYTOMETERFLOW CYTOMETERFLOW CYTOMETER 原理及应用原理及应用 BECKMEN-Coulter Epics XL 流式细胞分析仪流式细胞分析仪 流式细胞术流式细胞术 流式细胞术是利用流式细胞仪检测细胞或其它颗粒性物质的物理、化学特性。它借鉴了荧光显微镜技术与血球计数原理,同时利用荧光染料,激光技术,单抗技术以及计算机技术的发展,大大提高了检测速度与统计精确性,而且从同一个细胞中可以同时测得多种参数,为生物医学与临床检验学发展提供了一个全新的

2、视角和强有力的手段。FCM在生命科学中的应用,标志着细胞生物学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞和分子水平的研究。为从微观认识细胞及横向比较特征提供了精密、准确的方法和仪器.流式细胞仪的发展史1930 年 Caspersson 和Thorell 开始致力于细胞的计数1934 年 Moldaven 是世界上最早设想使细胞检测自动化的人他试图用光电仪记录流过一根毛细管的细胞1936 年 Caspersson 等引入显微光度术1940 年 Coons 提出用结合了荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白1947 年 Guclcer 运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计数器1949 年 Wallace Coulter

3、 提出在悬液中计数粒子的方法的专利1950 年 Caspersson 用显微分光光度计的方法在UV 和可见光光谱区检测细胞1953 年 Croslannd-Taylor 应用分层鞘流原理成功的设计红细胞光学自动数器同年Parker 和Horst 描述一种全血细胞计数器装置成为流式细胞仪的雏形1954 年 Beirne 和Hutcheon 发明光电粒子计数器1959 年 B 型Coulter 计数器1965 年 Kamemtsky 等提出两个设想一是用分光光度计定量细胞成分二是结合测量值对细胞分类1967 年 Kamentsky 和Melamed 在Moldaven 的方法的基础上提出细胞分选的

4、方法1969 年 Van Dilla Fulwyler 及其同事们在Los Alamos NM(即现在的National FlowCytometry Resource Labs)发明第一台荧光检测细胞计1972 年 Herzenberg 研制出一个细胞分选器的改进型能够检测出经过荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号1975 年 Kohler 和Milstein 提出了单克隆抗体技术为细胞研究中大量的特异的免疫试剂流式细胞仪与显微镜流式细胞仪与显微镜 FLOW MICROSCOPE光源激光自然光、灯光、氙(汞)灯对象细胞、生物粒子细胞、生物粒子承载工具载(盖)玻片鞘液及流动室检测信号 光学信号

5、形态及染色放大方式PMT，放大电路目镜X物镜统计人工，200计算机，5000结果简单，单参数多参数，综合分析流式细胞仪组成流式细胞仪组成 Cytometer 流式细胞仪主机流式细胞仪主机 Workstation 流式细胞仪工作站流式细胞仪工作站 Power Supply 电源箱电源箱三、几种常用的流式检测方法一、流式细胞仪的基本原理二、流式细胞仪的应用 一、一、流式细胞仪的基本原理 流式细胞仪构造流式细胞仪构造流路流路n流动室 n鞘液SHEATH n样本流SAMPLE 单细胞悬液5*1051*106个/ml光路光路n光源n滤片n光电倍增管PMT HV电路电路n放大电路HV及GAIN 增益nA/

6、D转换：不同的脉冲信号被转换成数字通道(CHANNEL)的 过程 统计：计算机统计：计算机液流液流系统系统:将细将细胞依序送到胞依序送到测量区受检测量区受检。光光学系统学系统:产生并收集荧光产生并收集荧光、光散射等信、光散射等信号号。电子系统电子系统:l将光学信号转换成电子信号将光学信号转换成电子信号。l分析所分析所输出的电流讯号输出的电流讯号，以，以脉冲脉冲高度、高度、宽宽度、度、积分面积显积分面积显示。示。l量化量化讯号并传至电脑讯号并传至电脑。综综合三合三个个系系统统的功能的功能:流式细胞仪的分选原理流式细胞仪的分选原理流式细胞仪主要技术指标流式细胞仪主要技术指标 1流式细胞仪的分析速度

7、流式细胞仪的分析速度2流式细胞仪的荧光检测灵敏度流式细胞仪的荧光检测灵敏度 3前向角散射（前向角散射（FSC）光检测灵敏度）光检测灵敏度 4流式细胞仪的分辨率流式细胞仪的分辨率 5流式细胞仪的分选速度流式细胞仪的分选速度 Single Parameter Histogram Dual Parameter Histograms 3-D Histograms免疫荧光分析免疫荧光分析 细胞表面的抗原细胞表面的抗原(或细胞膜受体或细胞膜受体)与相关的与相关的荧光抗体结合，形成带有荧光的抗原抗体复合荧光抗体结合，形成带有荧光的抗原抗体复合物。通过流式细胞仪测定其荧光量，即可得到物。通过流式细胞仪测定其荧

8、光量，即可得到细胞群的不同抗原位点表达情况。细胞群的不同抗原位点表达情况。免疫荧光分析的意义：免疫荧光分析的意义：流式细胞术与单克隆抗体结合，可对细流式细胞术与单克隆抗体结合，可对细胞表面和细胞内抗原、癌基因蛋白及膜受胞表面和细胞内抗原、癌基因蛋白及膜受体进行定量检测，成为临床检验的一项重体进行定量检测，成为临床检验的一项重要指标。流式免疫荧光技术不仅能将表达要指标。流式免疫荧光技术不仅能将表达不同抗原位点的细胞群区分开来，而且还不同抗原位点的细胞群区分开来，而且还能进一步区分各细胞亚群。对于造血系统能进一步区分各细胞亚群。对于造血系统疾病、免疫功能障碍及恶性肿瘤的诊断、疾病、免疫功能障碍及恶

9、性肿瘤的诊断、治疗及预后评估都起了重要作用。治疗及预后评估都起了重要作用。常用荧光染料介绍常用荧光染料介绍 荧光染料荧光染料 激发波长激发波长发射波长发射波长用途用途FITC488nm 525nm免疫标记免疫标记PE(RD1)488nm 575nm免疫标记免疫标记ECD488nm 610nm免疫标记免疫标记PE-CY5488nm 675nm免疫标记免疫标记PI488nm 620nmDNA分析分析7AAD488nm 675nm 区分死细胞区分死细胞PE-CY7 488nm 755nm免疫标记免疫标记 荧光素标记的单克隆抗体结合于细胞表面特异的抗原或分子，经过（或不）溶血后，上机检测相应抗原的表达

10、率和荧光强度。细胞表面分子或抗原分析膜渗透剂作用于细胞，细胞膜通透性增强，荧光素和特异性抗体进入细胞内与特异性抗原或分子结合，经过流式细胞仪检测胞内抗原的表达率和荧光强度。细胞内分子或抗原分析细胞微球试验：使用一系列荧光微球捕捉样品中存在的多种可溶性蛋白，通过流式细胞仪进行快速和灵敏的定量检测标本：血清、血浆、培养液、其他体液体液中可溶性分子的检测标本处理1 1，标本的获取，标本的获取2 2，标本的处理，标本的处理3 3，标本的转运，标本的转运4 4，样本的制备，样本的制备 标本获取标本获取常规标本来源常规标本来源 外周血和骨髓穿刺液外周血和骨髓穿刺液 培养细胞培养细胞 组织组织(实体瘤、脾、

11、肝实体瘤、脾、肝)标本是否合格标本是否合格 凝集、溶血、量太少或骨髓凝集、溶血、量太少或骨髓穿刺液无骨髓小粒均为不合格穿刺液无骨髓小粒均为不合格 标本的处理标本的处理标本的抗凝及存放时间标本的抗凝及存放时间肝素抗凝的外周血和骨髓标本，在室温的条件下肝素抗凝的外周血和骨髓标本，在室温的条件下（160C-250C），储存时限为），储存时限为48-72小时。小时。EDTA抗凝的标本，室温下储存时限只有抗凝的标本，室温下储存时限只有12-24小时。小时。ACD抗凝的外周血，室温下储存时限可达抗凝的外周血，室温下储存时限可达72小时小时ACD不推荐用作骨髓穿刺液的抗凝。不推荐用作骨髓穿刺液的抗凝。组织细

12、胞的处理：组织细胞的处理：机械法、酶法机械法、酶法对于要作胞浆内检测的标本，先固定，然后对于要作胞浆内检测的标本，先固定，然后可长时间的保存。但标本的保存时间要取决于抗原可长时间的保存。但标本的保存时间要取决于抗原的种类及染色的方法。的种类及染色的方法。虽然标本可以保存一定时间，虽然标本可以保存一定时间，但有条件应立但有条件应立即送检。因为死亡细胞会增加结果分析的难度。即送检。因为死亡细胞会增加结果分析的难度。新鲜血液和骨髓标本新鲜血液和骨髓标本抗凝新鲜血液和骨髓标本在室温条件下（注意不能低抗凝新鲜血液和骨髓标本在室温条件下（注意不能低于于100C或高于或高于370C），且在储存时限以内，可以

13、不作），且在储存时限以内，可以不作任何处理直接转运。但转运途中要注意不能剧烈震荡任何处理直接转运。但转运途中要注意不能剧烈震荡，以免溶血。，以免溶血。标本的转运标本的转运对于固定标本对于固定标本 根据不同的实验目的选择不同的固定剂。最常用的根据不同的实验目的选择不同的固定剂。最常用的是是4%的甲醛固定的甲醛固定15分钟。适用于各类蛋白质的检测分钟。适用于各类蛋白质的检测。70%冰乙醇，用于细胞周期分析的标本固定冰乙醇，用于细胞周期分析的标本固定 60%的酸性丙酮的酸性丙酮PH4.2，固定，固定10分钟。适用于血及分钟。适用于血及骨髓标本磷酸酶和酯酶的检测。骨髓标本磷酸酶和酯酶的检测。固定完全的

14、标本，可以转运和存放。固定完全的标本，可以转运和存放。对于需要作膜标记而送检又较远的标本对于需要作膜标记而送检又较远的标本 作膜标记一般需要保持细胞的活力，故需作膜标记一般需要保持细胞的活力，故需要要 Ficoll分离单个核细胞。然后加入分离单个核细胞。然后加入1640完完培，培，并含并含DMSO，置液氮或，置液氮或-700C转运。转运。标本的制备标本的制备 免疫标记（膜表面免疫标记（膜表面)的样本处理的样本处理 保证单细胞悬液：组织标本采用机械法、酶法。保证单细胞悬液：组织标本采用机械法、酶法。300目尼龙网过滤目尼龙网过滤调整细胞浓度：调整细胞浓度：25X106/ml，标记：取标记：取10

15、0ul样本样本+适量抗体适量抗体孵育：室温避光孵育：室温避光20分（或根据抗体说明）分（或根据抗体说明）（加二抗）（加二抗）溶血：溶血剂的选择（市售、氯化氨、草酸氨）溶血：溶血剂的选择（市售、氯化氨、草酸氨）检测：检测：免疫标记（细胞浆内免疫标记（细胞浆内)的样本处理的样本处理先将细胞膜先将细胞膜“打孔打孔”-破膜破膜破膜剂的选择：破膜剂的选择：Triton 皂素皂素 毛地黄毒甙毛地黄毒甙按前述方法进行标记按前述方法进行标记细胞周期分析的样本处理细胞周期分析的样本处理 传统方法：传统方法：单细胞悬液（如全血，则需分离单个核细胞）单细胞悬液（如全血，则需分离单个核细胞）冰乙醇固定过夜冰乙醇固定过

16、夜洗涤细胞洗涤细胞加复合染液（加复合染液（TritonTriton，RNARNA酶、酶、PIPI）20-3020-30分钟后上机检测分钟后上机检测BCBC公司公司DNA-PrepDNA-Prep试剂试剂溶血（如需要）溶血（如需要）固定染色一步完成固定染色一步完成2020分钟后上机检测分钟后上机检测 FCM是依据相对荧光量来反映所测定的物质。因此，测定时是依据相对荧光量来反映所测定的物质。因此，测定时相应的对照管是必不可少的。相应的对照管是必不可少的。细胞免疫功能受多种生理病理因素影响很大，下结论时应结合细胞免疫功能受多种生理病理因素影响很大，下结论时应结合临床临床选择抗体时要遵循以下原则：选择亲和力高的抗体；由于不同选择抗体时要遵循以下原则：选择亲和力高的抗体；由于不同的单克隆抗体针对的抗原表位不同，应该选用合适克隆的抗体；的单克隆抗体针对的抗原表位不同，应该选用合适克隆的抗体；由于抗原分子的表达程度不同，应选用合适的荧光标记，尤其由于抗原分子的表达程度不同，应选用合适的荧光标记，尤其是对于表达弱的抗原，应用强的荧光素标记；注意抗原表达在是对于表达弱的抗原，应用强的荧光素标记；注意抗原