《化妆品原料急性吸入毒性试验急性毒性分类法试验研究技术指导原则》..docx

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1、化妆品原料急性吸入毒性试验急性毒性分类法试验研究技术指导原则一、概述急性吸入毒性试验急性毒性分类法(AcuteInhalationToxicityAcuteToxicClassMethod,ATCMethod)是用较少的动物对一系列固定浓度的受试物进行逐步的急性吸入毒性测试,从而提供受试物吸入毒性特征信息，并确定受试物的急性吸入毒性及其分类的试验研究方法。该方法的目的是通过测试获得受试物对呼吸系统的健康危害信息，识别存在吸入暴露可能性的化妆品原料的急性吸入毒性，并参考联合国全球化学品分类和标签管理协调制度(theUnitedNations(UN)GloballyHarmonizedSystem

2、(GHS)ofClassificationandLabellingofChemicals)的化学品急性毒性分类标准，对受试物的急性吸入毒性进行分类。通过急性吸入毒性试验急性毒性分类法获得的受试物急性吸入毒性相关毒理学数据和资料还可作为确定28天/90天重复吸入染毒及其他相关毒理学试验设计和剂量选择的依据之一。本指导原则适用于单一成分的化妆品原料，非单一成分的原料若使用本方法进行评价，需要提供更多的科学依据说明其可行性。本指导原则适用于对可能存在吸入暴露的化妆品原料的毒性分类、研究及安全评估，不适用于某些特殊的材料，如难溶的等轴状(isometric)或纤维状(Ebre)US)材料、人造纳米材料

3、(manufacturednanomaterials)等的急性吸入毒性测试。本指导原则依据化妆品安全技术规范化妆品注册和备案检验工作规范化妆品注册备案资料管理规定化妆品新原料注册备案资料管理规定等相关要求，并参考OECD化学品测试指南第436号：急性吸入毒性试验急性毒性分类法、中华人民共和国国家标准GB/T28648-2012化学品急性吸入毒性试验急性毒性分类法等国内外相关技术指南制定。本指导原则是在现行法规和标准以及当前科学认知水平下制定的，随着法规和标准的更新完善，以及科学技术的发展，将适时进行调整。二、基本原则(一)一般原则本试验的设计应符合毒理学试验随机、对照、重复的基本原则，试验数据

4、应真实、完整、准确、可追溯，试验结果统计分析应科学合理。在进行动物试验时，应符合动物福利要求及“3R(即替代、减少、优化)原则”。本试验应在受试物不引起动物因腐蚀性或严重刺激性而造成剧痛或应激反应的浓度下进行。本方法以受试动物死亡率为试验观察终点，但在动物已处于剧痛、应激反应或濒死等状况下，从动物保护的伦理角度考虑，应遵循一定的程序对试验动物实施人道处死。对动物做出人道处死的标准及预测不可避免死亡的确认方法，可参考OECD指导性文件第19号：安全性评价中实验动物人道终点临床症状的识别、评估和应用。(一)具体问题具体分析本试验的设计应遵循“具体问题具体分析”的原则，根据受试物自身特点和性质、现有

5、数据、试验目的等选择合适的试验方法，设计适宜的试验方案，并结合其他毒理研究信息对试验结果进行全面的分析评价。根据本导则开展试验以前，应尽可能获得关于受试物的所有信息，包括能够支持可豁免某些试验的已有研究数据，以尽可能地减少所使用动物的数量。受试物特性、化学结构和理化性质等，受试物相关体外及体内毒性试验结果，受试物作为化妆品原料预期的使用方法/部位/目的以及可能暴露于人体的情况等，受试物结构相关毒性信息以及定量-构效关系(Quantitative)Structure-ActivityRelationship,(Q)SAR)数据等，以上这些信息可能有助于选择适合的动物种属、品系、性别、暴露方式和染

6、毒浓度。三、基本内容及评价要点本试验采用分步试验法，获得受试物急性吸入毒性的结果信息，从而对其急性毒性进行分类。具体方法为：从4个固定浓度中的起始浓度开始进行试验，通过观察动物吸入暴露于受试物4小时的反应，统计每一步试验出现死亡或濒死状态的动物数量，根据上一步的结果逐步增加/降低染毒浓度，并以其中较低的浓度界限值判定受试物的急性毒性分类。如出于特殊的试验目的，可选择其他的暴露时间。每一步固定浓度的染毒试验均应使用每性别3只动物。如有证据支持某种性别动物对受试物毒性反应更加敏感，可仅使用单一性别6只动物进行试验,并在报告中说明选择理由。上一步试验的结果决定了是否进行下一步试验：1)无需进行下一步

7、试验，或2)使用每性别3只动物进行下一步试验，或3)使用单一敏感性别6只动物进行下一步试验；整个试验过程中，根据动物死亡和/或濒死状态，可能2步试验即可判断受试物的急性毒性。在开展本试验研究时，应关注以下要点并遵循相应试验设计原则和要求，若需计算受试物急性吸入毒性的半数致死浓度(MedianLethalConcentration,LC50)值或进行染毒浓度一毒性反应关系的评价研究，可参考OECD化学品测试指南第403号：急性吸入毒性。（一）受试物制备和质量控制试验受试物可以是气体、蒸汽、气溶胶或它们的混合物，应根据化妆品原料的理化性质、实际工艺流程中的物理状态、拟用或已用于化妆品中的使用目的和

8、浓度等制备受试物。如受试物具有吸湿性，试验过程中需保证气体干燥；如受试物可能发生化学反应，需注意避免在可能发生爆炸的浓度下进行试验。受试物经超声雾化时会产热，应注意选择合理的发生装置。试验中为使整个呼吸道能充分暴露于受试物，推荐采用质量中值空气动力学直径（MassMedianAerodynamicDiameters,MMAD）为1m4m（几何标准差：L53.0）的气溶胶颗粒进行试验。若受试物无法达到上述标准，需由专家作出评判,并说明实际暴露时的粒径及其原因，例如吸湿性受试物在呼吸道内潮湿环境下粒径增加。磨损试验可证明原料是否会产生吸入性颗粒物，如试验结果证明可能产生吸入性颗粒物，则需要进行吸入

9、毒性试验。为了制备符合要求的受试物，首选水作为制备的溶媒载体溶剂。对受试物颗粒进行机械加工时，需注意是否可能引起物质分解和变性，例如过度研磨、摩擦产生高温等，因此试验前应检测分析受试物颗粒粒径和确认实际组成成分。实施试验过程中，应计算受试物靶浓度（或称目标浓度）、计算浓度（或称理论浓度、标示浓度）和实际浓度，但只有实际浓度可用来计算最终的半数致死浓度值（如需要）。计算浓度是制备的受试物量除以通过染毒装置的气体总体积得到的参数；实际浓度是染毒装置中动物呼吸区域的受试物浓度。比较计算浓度和实际浓度可得到试验系统的制备效率，以发现制备染毒气体过程中存在的问题。实际浓度可通过特异性方法（如直接采样法、

10、吸附或化学反应法，然后进行分析表征），或非特异性方法（如滤膜增重法）测量。对于单一成分的粉末或低挥发性液体的气溶胶和多成分的粉末气溶胶才能使用增重法，且使用增重法的前提条件是需要通过资料或在试验期间按照规定时间间隔分析所制备气体（或染毒装置内气体），证明气体中成分与最初的受试物成分相近。对可挥发或易升华的气溶胶,需证实所采用方法可收集到所有物相的受试物。整个试验过程中的每一步试验应使用同一批次受试物，技术上可行时，受试物保存条件应尽可能满足不影响其纯度、均匀性和稳定性。开始试验前应记录受试物特性（如纯度、技术可能情况下的物质鉴别、可鉴别的污染物和杂质含量），并可通过以下参数来证明：如保留时间、

11、相对峰面积，以及通过质谱或气相色谱等分析方法测得的分子量。检测机构可通过原料供应商获取以上受试物信息，但至少还需对接收的受试物性状进行一定程度的描述（如颜色、物理状态等）。应尽可能保持染毒气体持续不断，并根据分析方法采取连续或间隔采样监测。当采用间隔采样，染毒4小时内至少采样2次。如果因系统内染毒气体气流量或浓度过低所限，整个暴露周期内可采样一次样本。如所采集样本间出现明显波动，进行下一个染毒浓度试验时需要在暴露周期内采样4次。每个染毒浓度试验期间各样本间的浓度波动范围应符合以下标准：气体和挥发性受试物的平均浓度波动不得超过10%,液体或固体气溶胶的平均浓度波动不得超过20%。整个染毒周期包括

12、受试物气体制备时间和装置内受试物气体达到平衡时间（T95）。应计算并记录T95o对于成分极为复杂的蒸汽/气体和气溶胶混合物在染毒装置中的每一物相成分各不相同，因此在每一物相（蒸汽/气体和气溶胶）中至少选择一种标志性物质（通常为受试物组分中的主要活性物质）进行分析。当受试物为混合物（如复配原料）时，分析报告中的浓度应为全部配方的总浓度,而非活性成分或某种成分的浓度。气溶胶粒径的测定需在染毒4小时内至少采样2次，可采用级联撞击采样器或其他设备如空气动力学粒径仪等，若使用后者，需验证其测定结果与前者测定结果相同。同时应采用第二种方法（如滤膜增重或撞击采样器/气溶胶雾化器）进行平行测定，来验证第一种方

13、法的收集效率。粒径分析所得质量浓度应处于由滤膜分析法所得质量浓度的合理的限度范围内。如在试验早期阶段可证明两种方法所得结果相同，则可豁免进一步验证试验。从动物福利方面考虑，应尽量减少无法获得结论的数据，以避免重复进行试验。如受试物蒸汽可能冷凝形成气溶胶或受试物蒸汽中测得的颗粒物可能以混合相的形式存在，需对此类受试物进行粒径测定。（二）实验动物通常选用年轻、性成熟的成年动物，雌性动物未经产、未妊娠。首选大鼠（812周龄），若选用其他动物种属，需说明理由和依据。动物的体重应控制在与上一步骤试验中相同周龄、相同性别动物的平均体重相差不超过20%。动物试验分组应符合随机分配和对照原则。所有动物（通常指

14、大鼠）刚到达实验动物房后应经过至少5天后再开展试验，使动物适应饲养环境；试验前还需对动物进行短期适应训练，以减少因进入新的环境和染毒设备而造成的应激反应。动物饲料应有检验合格证明。饲养过程中应保证动物能自由摄食和饮水。染毒暴露前和结束后，实验室内温度、相对湿度和光照条件应符合国标实验动物环境及设施中的要求，并保持相对稳定。染毒结束后，实验动物按照不同性别和染毒浓度分笼饲养，以便对每只动物进行观察、防止笼内动物之间因斗争、撕咬影响结果观察。（三）染毒条件控制应根据受试物特性和试验目的选择染毒方式，一般采用口鼻暴露（Noseonly）或全身暴露（Wholebody）的方式，在OECD指导性文件第3

15、9号：急性吸入毒性试验中对口鼻暴露和全身暴露染毒方式的技术原理和各自的优缺点进行了说明。当受试物为液体、固体气溶胶和能产生气溶胶的蒸汽时，首选口鼻暴露方式，包括仅头部、鼻部、口鼻部暴露三种染毒方式。口鼻暴露方式中受试物在染毒体系中易于均匀分散、不易发生变化，暴露系统中需要的气体体积少，受试物能够快速达到均匀分布，且该暴露方式可更大程度地减少动物经非吸入途径的受试物暴露。但这种方式会限制动物的活动，因此当采用口鼻暴露时，应保证固定装置不会对动物产生额外的应激反应，如由于固定装置与动物体积大小不匹配产生的应激反应、固定装置发热产生的应激反应等，并确保动物在暴露过程中无法避开吸入染毒气流。若动物固定

16、装置可能对动物生理状态造成影响，如造成动物体温和每分钟呼吸量(ReSPiratoryminutevolume,RMV)升高等，则需提前将动物放入固定装置使其适应环境。当进入暴露染毒系统的空气体积小于流出体积时，应防止空气经其他途径(如经固定装置)进入暴露系统使受试物气溶胶稀释。暴露系统应处于密闭的染毒装置，保证染毒装置内部处于负压状态以防止受试物泄露到外部环境中。应保证染毒装置内氧气浓度不低于19%,二氧化碳浓度不高于1%,并确保每只动物受试物暴露的雾化条件稳定均一。在采集气溶胶样本时，可适当调整采样流量的大小，以保证暴露系统内条件稳定。如出于特殊的试验目的需采用全身暴露染毒，需在试验报告中说明理由和依据。全身暴露染毒是将动物置于封闭的染毒装置内进行雾化吸入暴露，全身暴露装置需配备动态气流，一般每小时换气约12次15次。染毒装置内应保持负压状态以防止受试物泄露到外部环境中。应保证染毒装置内氧气浓度不低于19%,二