化妆品扩展一代生殖发育毒性试验方法、两代生殖发育毒性试验方法.docx

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1、附件11扩展一代生殖发育毒性试验方法ExtendedOne-GenerationReproductiveToxicityStudy1 范围本规范规定了扩展一代生殖发育毒性试验基本原则，试验方法和技术要求。本规范用于检测化妆品原料的生殖发育毒性。2 试验目的提供关于受试物产前、产后暴露对雌性、雄性动物生殖功能、生育力及子代发育影响的确切信息。3 定义3.1 生殖毒性Reproductiontoxicity对后代产生有害作用，并损伤雄性和雌性的生殖功能和生殖能力。3.2 发育毒性Developmentaltoxicity生殖毒性的表现，具体表现为后代在产前、围产期、产后发生的结构和功能紊乱。3.3

2、 神经发育毒性Neurotoxicity个体在发育过程中暴露于受试物后引起的神经系统结构和功能的异常改变，这种改变可以发生在生命周期的任何阶段。3.4 发育免疫毒性Developmentalimmunotoxicity个体在其生命早期发育过程中（尤其是出生前后）暴露于受试物后导致的免疫系统发育受到影响、功能出现障碍，而这些影响在成年个体暴露时未被发现或持续时间较短。3.5 母体毒性Maternaltoxicity受试物引起亲代雌性妊娠动物直接或间接的健康损害效应，表现为增重减少、功能异常、毒性反应、甚至死亡。3.6 未观察到有害作用剂量NOAEL通过动物试验，以现有的技术手段和检测指标未观察到

3、任何与受试物相关的毒性作用的最大剂量。3.7 观察到有害作用的最低剂量LOAEL在规定的条件下，受试物引起实验动物组织形态、功能、生长发育等有害效应的最小作用剂量。4 试验的基本原则通过对实验动物以受试物暴露，考察其对雄性和雌性动物生殖功能、生育力及生殖系统形态的影响。若该暴露（直接或间接）持续至子代，则还可以继续考察受试物对子代发育，甚至子代生殖功能和生育力的影响。5 受试物配制化妆品生殖发育毒性试验一般采用经口途径给予受试物，但基于人的可能暴露途径或受试物的特性而选择经皮或吸入也是合适的。溶媒对照应采用与之相同的给予途径。若设置阳性对照，其处理方式可以不同于受试物处理组。一般情况下首选水作

4、为溶媒，可以是水溶液也可以是混悬液，其次可以选择玉米油作为溶媒配制成乳浊液，也可以将其与水混合配制成油溶液。使用水以外的其它溶媒，应阐明其毒性并保证所配制溶液的稳定性。应避免使用具有潜在内在毒性的溶媒（如丙酮、二甲基亚飒）。其它应纳入考虑的因素包括：溶媒是否影响受试物化学特征继而改变受试物毒性；溶媒是否影响受试物的吸收、代谢、分布和蓄积；溶媒是否影响动物食物和饮水摄入继而影响营养状况；溶媒本身是否有潜在毒性。经口灌胃时，以大鼠为例，水溶性液体的灌胃体积一般不超过IOmLkg体重，最大不超过20mL/kg体重；油溶性液体的灌胃体积不超过4mL/kg体重。每只动物的受试剂量通常应基于最近测定的个体

5、体重，成年雄性和成年未怀孕雌性至少每周校准一次剂量，怀孕雌性和Fl动物在断奶前和断奶后2周内每两天校准一次剂量。如果毒代动力学数据表明受试物的胎盘透过量较低，则可能需要调整妊娠最后一周的灌胃剂量，以防止对雌性动物造成额外的毒性。雌性在分娩当天不应通过灌胃或任何其他方式给予受试物，以免干扰分娩过程。经饲料或饮水给予时，应充分考虑溶媒添加量和动物热量的摄入。若使用溶媒，那么对照组应按受试物组的最高使用量添加；若不使用溶媒，且受试物会造成摄食量或食物利用率的降低，那么可以通过将其饲喂未交配动物作为配对对照组，但是，如有资料表明食物消耗的降低并不影响生殖相关参数，可以不设置配对对照。若无特殊理由建议通

6、过口服给药。经皮给予受试物时，应考虑受试物浓度对皮肤的刺激性。若在既定剂量下的浓度产生较为严重的皮肤刺激性，应将浓度适当降低。当然，这种降低可能也伴随剂量的降低。如果因浓度过高，在早期就出现皮肤严重受损的情况下，应终止试验并选择合适的浓度重新开始。受试物皮肤暴露面积应达到动物全身皮肤的10%,毒性过高的受试物也可以小于10%o可以采用纱布和无刺激性胶带将受试物固定在皮肤表面，需要保证每天6小时的接触时长，同时也可以采用非保定方式（如防抓咬保护脖套）防止动物摄入受试物或弄掉封闭胶带。经吸入给予受试物时，一般采用气体、蒸汽、气溶胶或以上混合形态进行受试物暴露。吸入受试物所采用的暴露物态应根据其理化

7、性质、拟定浓度和/或其实际应用时的物态加以确定。不论采用头鼻暴露还是全身暴露，染毒柜内氧气浓度含量不低于19%,二氧化碳含量低于1%,同时确保受试物浓度稳定。6 实验动物和饲养环境6.1 实验动物选择首选种属为大鼠，若选择其它种属动物应有合理理由，同时应避免选择生育力低且具有明显发育缺陷的动物种属。所选动物应健康且未经历任何试验，其中雌性动物应为未经产或未孕动物。试验开始时动物体重的差异应不超过平均体重的20%,若有必要还应基于发情周期筛选动物，将发情周期正常的雌性纳入试验。6.2 动物数量应保证每组至少有20只怀孕雌性动物，在极端情况下，未能产生足够的怀孕动物时，不表明研究数据无效，需个案分

8、析。雄性动物数量推荐与雌性动物保持一致。6.3 动物的准备和饲养动物抵达实验设施后，应有不少于5天的环境适应期。实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。选用标准配合饲料，饮水不限制。但应注意饮食和垫料中植物雌激素的含量，避免影响某些生殖终点。所用批次饲料留样并适当保存至报告完成，以便在某些情况下进行回溯分析。动物交配前可以多只动物饲养于一笼，雌性动物交配成功后（检查到阴栓或阴道涂片阳性）应单笼饲养于含垫料的笼具内，其所产Fl代同笼饲养至离乳。离乳后的Fl代应按组别、性别分笼饲养，如有合理理由亦可单笼饲养。7 暴露途径选择应选择与人的可能暴露途径最接近的方式。可根据受试物的物化特性选择合适的暴露

9、途径。8 受试物资料分析在开始试验前，充分了解受试物的相关信息，如物化性质，毒代动力学（ToxicokineticsjTK,包括物种特异性代谢）特征，毒性效应特征，结构活性关系，体外代谢过程，已有毒性研究结果和结构类似物等，对于决定受试物的暴露途径、溶媒选择、实验动物种属选择、剂量选择等具有重要意义。参考先前剂量探索研究中的TK数据对于选择剂量水平和解释结果非常有用。包括：（1） 已经明确了的关于发育中胎儿和幼仔暴露于受试物或其相关代谢产物的资料；（2）提供的体内剂量估计值；（3） 对潜在的剂量依赖性饱和动力学过程的评估资料如果有其他的TK数据，如代谢物谱、浓度-时间曲线等，也应予以考虑。总的

10、来说，对于设计扩展一代生殖发育毒性试验具有重要参考价值的TK数据来源如下：（1） 妊娠晚期（例如GD20）母体和胎儿血样；（2） 哺乳中期（例如PNDlO）母体和幼仔血样或乳汁；（3） 离乳早期（离乳PND28）离乳血样。参考TK数据时,应灵活分析。需注意数据是来自受试物原物还是代谢产物，基于多少个采样点得出，其暴露途径如何等。9剂量和分组9.1 常规剂量设计通常情况下，设置3个剂量组和1个溶媒对照组。剂量水平的选择应参考已有毒理资料，如非妊娠动物的TK数据，受试物的血乳屏障透过率，人体暴露估计等。在有TK数据的情况下，相关资料表明受试物具有剂量依赖饱和特征，且人体暴露量远低于饱和剂量，设置受

11、试物高剂量时选择动力学曲线向非线性转变的拐点比较适合，可避免出现饱和。在缺乏TK数据支持的情况下，剂量水平的选择应基于受试物的毒性，如高剂量应产生一定程度的全身毒性，但不致死或造成动物严重的痛苦。在高剂量以下按等比关系设置中低剂量，低剂量应能够确定NOAEL或可以用于推导基准剂量（BenchmarkdosgBMD）O为避免NOAELS和LoAELS间距过宽，2-4倍的剂量间距较为合适，不宜采用过大的间距，如拟设间距超过10,则应采用增加剂量组的方法以降低间距。若有溶媒对照，溶媒对照应采用受试物处理组用到的最大体积作为本组动物的给予体积。9.2 限制剂量试验人的可能暴露水平低于100Omg/kg

12、是开展限制剂量试验的前提条件。在重复剂量毒性试验中高于IoOomgkg的情况下无毒性表征，或者无结构或代谢类似物的相关资料，那么仅设计1000mg/kg的单剂量水平已足够。若在此剂量水平观察到生殖发育毒性，则需要在更低剂量水平确定NOAELo10试验内容10.1 试验步骤FO的雌雄动物均应于交配前2周开始接受受试物处理，并一直持续至子一代（Fl）离乳。其中，用于评价精子活力、睾丸和附睾组织病理变化的FO雄性动物应至少保证10周的暴露期。（流程见附图）Fl代动物一般情况下在离乳时接受受试物处理，但是如果有资料显示受试物具有较差的血乳屏障透过率或不能明确受试物是否能透过血乳屏障，则应考虑在哺乳期直

13、接对Fl代动物进行受试物处理并一直持续至解剖。Fl代动物在离乳时（PND21）随机从每窝选取一雌一雄用于初步评估Fl的生殖系统毒性和全身毒性（序列1A）。在满足触发条件的情况下，需要额外选取Fl开展其它子代潜在毒性测试，如：潜在生殖毒性的追加评价（IB）、潜在神经发育毒性（2A&2B）、潜在发育免疫毒性（3）o序列IA用于初步评估FI生殖系统和全身毒性，每窝一雌一雄；序列IB在需要开展进一步生殖毒性研究时，交配产生F2以在受试物具有疑似生殖或内分泌毒性的情况下，或当队列IA的结果不明确时，获得额外的组织病理学数据，每窝一雌一雄。序列2A用于神经行为学及神经组织病理研究，每窝一雌一雄；序列2B用

14、于离乳时的神经组织病理研究，每窝一雌一雄；序列3用于发育免疫毒性研究，每窝一雌一雄。试验流程见附图。以上序列中IA为必选，其余序列均有对应的触发条件,具体见附表。10.2 交配同剂量组的雌雄大鼠按1:1进行交配，交配最多持续2周。通过在早晨检查阴栓或阴道涂片来确定交配成功与否，一旦确定交配成功的雌性应单独饲养，并把发现交配成功的当天定为妊娠第0天（G0）。如若交配不成功，应选择同组已成功交配的其它雄性继续交配，配对信息应准确记录。在离乳动物中，从每窝选取至少一雌一雄在性成熟后进行交配且交配应在同组不同窝间开展。Fl的选取应遵循随机原则，但体重不应低于每窝平均体重两个标准差。通常情况下不推荐进行

15、二次交配，因为二次交配将丢失着床信息。但是，如出现受试物相关的窝产仔数变化或第一次交配中观察到可疑的结果，仍建议FO或Fl再次交配。同时，也建议将未成功怀孕的雌性动物与能正常生育的雄性进行二次交配，以确证雌性生育力。二次交配的时间应选在最后一胎离乳后大约一周左右。10.3 窝的标准化在出生后第4天,通过随机选择调整窝的大小,尽可能达到每窝每性别5只，若难以达到，做部分调整也可接受（例如：4只雌性和6只雄性）。窝的标准化应注意不以体重及肛殖距（AGD）为依据。10.4 临床观察每天至少1次临床观察，观察的时机应考虑与血浆峰浓度相关的毒性症状出现的时间，观察内容包括但不限于行为改变，难产或分娩时间

16、过长，妊娠天数及其它毒性症状。离乳后，每周至少1次更为详细的临床观察可在称重时进行，观察内容包括但不限于：皮肤、毛发、眼睛、粘膜的变化，分泌、排泄的发生以及自主活动情况，步态、姿势、对外界刺激的反应，是否有痉挛、肌肉强直，刻板症等。每天至少2次的笼旁观察主要观察动物严重的毒性反应、患病和死亡。出生当天，尽快进行检查幼仔的数量、性别、存活与否以及是否存在明显外观异常（包括腭裂、皮下出血、皮肤颜色或质地异常、脐带存在与否、腹部奶斑、是否存在干结分泌物）。此外，新生幼仔的初次临床检查应包括体温、活动状态和对刺激的反应。对死亡幼仔应检查可能存在的缺陷和死亡原因。存活幼仔在PNDO到PND4期间测量一次肛殖距（AGD）并定期测量体重，至少应在PNDO（PNDl）PN