附件5实验项目技术操作步骤简介docx.docx

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1、L总RNA提取(约20-2.5h)I .引言从人组织/细胞中提取基因组RNAII .缩写III .试剂和材料EP管，DEPC水、刀片、液氮、TriZol溶液、氯仿、异丙醇、75%无水乙醇、异丙醇、组织样品/细胞IV .仪器细胞安全柜、离心机、研磨机、核酸蛋白检测仪V .试剂配方实验准备：清洗研磨柱：流水冲洗后用刷子刷两遍，漂白粉浸泡Iomin后流水冲；ddH2O冲洗两遍后，加75%乙醇超声清洗3min；再用ddH2O冲洗两遍后，加ddH2O超声清洗3min。最后再用DEPC水冲洗后烘干。VI .Protocol -(0.5h) (20mln) (20min) (20min) k(20min)

2、(15min)2.反转录(约1.Oh)I .引言反转录是以RNA为模板，通过反转录酶，合成DNA的过程。II .缩写III .试剂和材料RNA样品、反转录试剂盒IV .仪器细胞安全柜、PCR仪冰盒、中小枪头、八联管及盖子、1.5mlEP管V .试剂配方VI .Protocol去除基因组DNA反应k(20min)反转录反应一(0.5h)3 .荧光定量PCR(约3.0h)L引言Real-timePCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累对整个PCR进程进行实时监测，最后通过Cq值和标准曲线对起始模板进行定量分析的方法。试剂和材料引物：生工、华大等生物公司合成引物酶：ProTaqHSS

3、YBRGreen预混型qPCR试剂模板：cDNA、质粒等ddH20L仪器荧光定量PCR仪(0.5h)(0.5h)(2h)IV体系2XProTaqHSSYBRGreen5uL模板质粒约50ngcDNA约200ng上游引物IuL(0.4-IuM)下游引物IuL(0.4-IuM)ddH20补足至IOuL总体系IOuLV.程序955min955s35-40cycles58IOs7220s（时间依据酶的扩增效率及目的产物长度）72IOmin4 .SiRNA干扰(细胞培养+转染约2-3天)I .引言RNA干扰是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，它是当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时

4、，该mRNA发生降解而导致基因沉默的现象。通过siRNA与同源的靶RNA互补结合，使特异性酶降解靶RNA,从而抑制或下调基因的表达。II .缩写III .试剂和材料IXriboFECTCPBuffer(V2)、20UMSiRNA储存液(V3)、riboFECTn,CPReagent(v4)IV.仪器细胞安全柜、V .试剂配方VI .ProtocollriboFECTMCPReagent转染SiRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器的试剂用量请参考表2,若使用其它转染试剂，请参考对应转染试剂说明书。SiRNA终浓度银孔体积培养基(5)Buffer(v2)NA(v3)ReaNtg9

5、6-wellIOOnM100l9290l6l0.5l06l50nM100l9315l6l0.25l0.6l30nM100l9325l6l0.15l0.6l20nM100l93.30l6l0.1l0.6lIOnM100l9335R6l0.05l0.6l24-wellIOOnM500l464.50l30l2.5R3l.50nM500l465.75l30l1.25l3l30nM500l46625l30l0.75l3l20nM500l46650l30l0.5l3lIOoM500l466.75l30l0.25l3W12-weUIOOnMIml929.00l60l5l6l50IMIml93150l60l2

6、.5l6l30nMIml932.50l60l.s6l20nMIml933.l60lll6lIOnMIml933.50l60l0.3l6l6-well100nM2mllS58.00l120l10l12l50nM2ml1863.00l120l5l12l30nM2ml1865.00l120l3l12l20IM2ml1866.00l120l2l12lIOnM2ml1867.00l120lll12l接种细胞，过夜培养稀释SiRNA献混合液制备转染细胞16h后细胞换液，过夜培养重复转染步骤1次(Ih)(20min)(20min)(10min)(10min)(培养4872h )5.ShRNA质粒包病毒与细胞

7、转染（细胞培养+转染23天）I .引言慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-I基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。II .缩写III .试剂和材料ShRNA质粒，3个，-80C。保存，用前室温复温control(shRNA阴性对照)，-80C。保存，用前室温复温包

8、病毒质粒：psPAX2,PMD2G,-80C。保存，用前室温复温PCDH(GDF)：荧光对照，评价P日转染效率,-80C。保存，用前室温复温293T细胞，10%FBSinDEME,37Co,5%CO2.8090%密度PEIlugul,-20C保存，用前室温复温OptiMEM,4C。保存，用前室温复温，若有沉淀，吹打混匀HaCat细胞：10%FBSinDMEM,37Co,5%CO2聚凝胺：solarbio,cat#H8761IV .仪器细胞安全柜V .试剂配方VI .Protocol1.病毒包装接菌，过夜培养质粒提取293T细胞铺板，培养过夜病毒包装I6h后细胞换液，过夜培养病毒液收集-(0.5

9、h)一 (2h) (Ih)(Ih)k (10min ) (0.5h )细胞铺板，过夜培养病毒液转染6诟细胞换液，培养过夜二次转染6h后细胞换液，过夜培养嗯吟毒素筛选I48h 后细胞消化，富集培养一(Ih)一(Ih) (IOmin )(Ih) (10min )(0.5h )Ik ( 0.5h )分子克隆6.普通分子克隆（总耗时4天）I .引言分子克隆技术是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的

10、许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。II .缩写PCR:PolymeraseChainReactionIII .试剂和材料列出推荐的供货商，试剂和材料严格按规定使用。（有比推荐的同等或更好的产品，可以在必要时使用）PCRmix（或其他DNApolymerase供货商：Thermo）Endodeoxyribonuclease（供货商：NEBZthermo）Vector（供货商：生物公司）Ligase（供货商：NEBZthermo）DNA基因组提取试剂盒（供货商：TiangenZAxygen）质粒提取试剂盒（供货商：TiangenZAxygen）DNA纯化试剂盒（供货商：TiangenZOmega）

11、一次性无菌离心管（供货商：JETBIoFlL和GEB）50ml离心管、15ml离心管、1.5ml离心管、PCR管（供货商：JETBIOFIL）IV .仪器低速离心机、高速离心机、4C展示柜、-20C冰柜、PCR仪、水平电泳仪、凝胶成像系统恒温水浴箱V .试剂配方氨节青霉素、硫酸卡那霉素、LB培养基、限制性内切酶、连接酶、感受态细胞等。VL实验类型1.PCR扩增目的基因引物设计、合成3day普通PCR24h产物检测12h纯化|Th2）实验评估：本实验为普通PCR克隆基因片段实验，包括对目的基因设计特异性引物，PCR条件的摸索及优化，PCR产物的检测及纯化，总耗时不低于4天。3）本实验结果报告：包

12、括各试剂品牌、货号，实验操作具体步骤以及琼脂糖凝胶结果及纯化产物浓度、纯度等相关数据。7.酶切、连接、转化（耗时5天）纯化PCR产物酶切2h产物、载体连接24h感受态细胞转化23h46h23d2）实验评估：本实验为载体重组实验，包括对目的基因和载体的特异性切割及连接，转化，单克隆筛选及鉴定，总耗时不低于5天。3）本实验结果报告：包括各试剂品牌、货号，实验操作具体步骤以及琼脂糖凝胶结果及测序报告等相关数据。8.蛋白表达、纯化（耗时10天）I.引言目的蛋白表达与纯化是通过原核或真核表达系统对R的研究基因进行外源表达后经过纯化手段获得较纯的蛋白，旨在蛋白水平进行基因的相关研究。IL缩写NI-NAT:

13、银亲和层析柱IPTG:isopropy-D-thiogalactosideIII.试剂和材料列出推荐的供货商，试剂和材料严格按规定使用。（有比推荐的同等或更好的产品，可以在必要时使用）LB培养基（供货商：thermo）、NI-NAT（供货商：广州化学试剂厂）、GST树脂（供货商：广州化学试剂厂）、脱脂牛奶（供货商：BD）.无钙镁离子PBS（供货商：TBD）,吐温20（供货商：Sigma）Washingbuffer（供货商：广州化学试剂厂）、IPTG（sigma）SDS-Page配胶试剂（供货商：Iherm0）、考马斯亮蓝（供货商：Sigma）、溶菌酶（供货商：Sigma）、一次性无菌吸管（供货商：JETBlOFlL）、25ml吸管、IOml吸管、一次性无菌离心管（供货商：JETBloFIL和GEB）、50ml离心管、15ml离心管、L5ml离心管IV.仪器低速离心机、高速离心机、超声仪或匀浆机、4C展示柜、-20C冰柜、电磁炉加热器、垂直电泳槽、空气恒温摇床V.试剂配方原核表达纯化及真核表达纯化相关试剂原核表达：筛选抗生素、LB培养基、IPTG真核表达：1640、DMEM等细胞培养基VL实验类型1.原核蛋白表达、纯化重组载体转化表达菌1