腺病毒载体操作手册1407.docx
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1、腺病毒载体操作手册一、试验流程制备腺病毒穿梭质粒,分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒,共转染293A细胞,转染后6h更换为完全培育基,培育十几天,在中间四五天左右更换一次新奇培育基,然后收集细胞和ImI培液置于15ml离心管后,液氮/37度冻融三次(冻-融要彻底),200OrPm离心5分钟,取上清即为病毒液初代原液。连续三代反复扩增收集病毒后,行病毒的大量扩增,然后通过CSCl密度梯度离心透析联用法纯化病毒。二、试验材料(-)腺病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为两质粒系统,组成为穿梭质粒(包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBA
2、d-U6-GFP,pHBAd-U6-RFP)和骨架质粒pBHGIox(delta)E1,3Creo其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白(GFP)OpHBAd-CMV-IRES-RFPPHBAd-U6RFP能表达红色荧光蛋白(RFP)。1、载体信息1)腺病毒克隆载体图谱如下:SacU/xbal(45NotI)(731)Amp,/oRK742),(NddRSNM)I/(NdeD一(NCOI)IINhcKl384),4pHBAd-U6AcaIISacIIIXbal(456)Notl)rALirA呷/=;/(NdCl7A,5)(NO(I)(-YI
3、INheI(1384)pHBd-U64lFPY噜RjcIRjK/CMVhitZZr町/XEcoRlAmpr/、BgID,*wSPHBAd-MCMV.RFPJBr5337bpNhefV:奢pUCAgelI,、pSV4OPoIyAc,a,各载体用途如下表:腺病毒载体名称干扰pHBAd-U6-GFP,pHBAd-6-RFP过表达PHBAd-CMV-IRES-GFP,PHBAd-CMV-IRES-RFP标记示踪PHBAd-CMV-IRES-GFP,PHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-6-GFP,pHBAd-U6-RFP2)骨架质粒信息如下:SV40ANICreHCMVIE1.ampIox
4、P4p,xpBHGIox(delta)Elz3Cre34707bp2、细胞株293A,腺病毒的包装细胞,为贴壁依靠型成上皮样细胞,经培育生长增殖形成单层细胞,生长培育基为DMEM(含10%FBS)o3、菌株大肠杆菌菌株DH5o用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。三、包装细胞293A细胞的培育(-)293A细胞的冻存293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆,具有易使用和易转染的特性。该细胞株对于高细胞密度很敏感,当细胞超过70%汇合时,一些细胞可能会丢失它们的表型。若细胞密度持续在70%以下,QBI293A细胞则能连续培育34个月维持原有细胞特性。若以购买得到的293A作为第一代,则30代
5、内能得到最佳结果。随着传代的次数增加,293A细胞会消失生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的消失,我们需要在开头就对细胞进行大量冻存,以保证明验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存,增加细胞复苏成活率。1、去掉上清液,加入PBS洗去残留的培育基;2、加入0.25%的胰酶,消化12min后,镜下观看细胞变圆,细胞间间隙加大时,去除胰酶,加入新奇培育基吹打混匀,移入离心管中。3、细胞计数,将细胞全部晃下,加入3mL37预热的10%DMEM,用WmL移液管进行吹打,较大力吹打6-8次即可,不留死角,之后,将全部细胞吸出,置于15mL离心管中,取50ul混匀后的细胞于1BmLeppendor
6、f管中,力口入450ul10%DMEM,即为10倍稀释,混匀,取Wul细胞于计数板中计数。计数板上共4大格,每大格16小格。计数时,4大格均计数,总数除以4(得每大格细胞数),再乘以10(10倍稀释),即为实际n万mL细胞浓度。4、细胞离心,IoOOrPm,5min0去掉上清。5、依据细胞计数结果加入细胞冻存液(70%完全培育基20%FBS+10%DMSO),重悬细胞,密度为3x106个mL6、分装进细胞冻存管,放入冻存盒中,放入-80超低温冰箱。7、其次天将细胞放于液氮罐中长期保存,并作纪录。保存过程中,要不时复苏细胞检测细胞存活率,观看细胞状态等。(二)293A细胞的传代当细胞生长到汇合率
7、达到80%90%时需要对细胞进行传代操作,以扩大细胞数量,维持细胞良好的生长状态。1、消化细胞,方法同细胞冻存。2、细胞离心结束后,加入完全培育基重悬。3、依据具体状况,将细胞分到IoCm培育皿中,每个培育皿补足到IOml培育基。4、将培育皿平稳放回37、5%CO2和95%相对湿度的培育箱中培育。()293A细胞的复苏当细胞传代次数过多,细胞状态变差时,或者细胞消失污染事故时,需要丢弃并对最初冻存的细胞进行复苏。1、设置温度为3742C的水浴。2、查看细胞库纪录,依据纪录从液氮罐中取出冻存的细胞(需戴上棉手套,防止被冻伤),快速丢入水浴锅中并快速晃动,尽量在1-2min内使细胞溶液完全溶解。3
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